МЕТОД ГОМОЗИГОТИЗАЦИИ МАТЕРИАЛА В КУЛЬТУРЕ ИЗОЛИРОВАННЫХ МИКРОСПОР ЯЧМЕНЯ

МЕТОД ГОМОЗИГОТИЗАЦИИ МАТЕРИАЛА В КУЛЬТУРЕ ИЗОЛИРОВАННЫХ МИКРОСПОР ЯЧМЕНЯ Работа выполнена в рамках гранта МОН РК по теме: «Технология культуры изолированных микроспор в создании генетически однородных и стабильных сортов ячменя» № гос. регистрации 0112 РК 02744

частоты регенерации in vitro сортов ячменя в культуре изолированных микроспор; -Оптимизация параметров культуры клеток и регенерации растений in vitro; - Отработка первичного протокола культуры микроспор ячменя - Повышение Задачи исследований: сортов ячменя для улучшения биотехнологическими методами. Выбор условий для дигаплодизации генотипов ячменя в массовых масштабах. - Цитологические методы определения плоидности растений. - Отработка эффективной технологий ускоренной гомозиготизации генотипов ячменя (культура микроспор). - Разработка культур микроспор выбранных сортов, регенерация растений, удвоение хромосом. - Отбор

9, 5 -12, 5 cм 16 -18 cм 1. длина верхнего междоузлия – 16 -18 см, длина колоса – 4. 5 -6. 5 см 2. длина верхнего междоузлия – 9, 5 -12, 5 см, длина колоса – 3. 5 -5 см Рисунок 1.

РИСУНОК 2. Микроспоры: A - свежевыделенные; B - после деления

Рисунок 3. 1 – эмбриоидоподобные структуры (каллусы, эмбриоиды) на питательной среде 2 – меристематические очаги на регенерационной питательной среде

Рисунок 4. 1 – растения на питательной среде для регенерации 2 - доращивание растенийрегенерантов в грунте

Сорта и линии ячменя Айдын Байшешек Береке 54 № 275 -1 Фаза развития микроспор поздняя одноядерная ранняя двуядерная 36 31 39 40 34 35 35 42 % пыльников с новообразованиями поздняя одноядерная ранняя дву -ядерная 0. 45 ± 0. 84 0. 37 ± 0. 08 2. 74 ± 0. 108 4. 57 ± 0. 108 0. 32 ± 0. 06 0. 20 ± 0. 14 0. 27 ± 0. 03 0. 41 ± 0. 39

Вариант опыта Количество Частота новообра- регенерации зований, шт. Количество зеленых растений Количество альбиносов штук 6% сахароза 175 6% мальтоза 95 97 6% сахароза+ актив. уголь % штук % 94 53, 7 75 80, 5 19 19, 5 67, 4 73, 4 25 25, 8 64 10 98, 4 44, 1 2 15 1, 6 56, 8 Fфакт. - - 24, 2 - 22, 6 НСР 05 - - 12, 4 - 13, 1

Компоненты среды KCl Mg. SO 4 x 7 H 2 O Ca. Cl 2 x H 2 O Маннитол (0. 3 M) p. H=7. 0 мг/л 1490 250 150 54 630

Компоненты среды мг/л KNO 3 2830 (NH 4)2 SO 4 463 KH 2 PO 4 400 Ca. Cl 2 x 2 H 2 O 166 Mg. SO 4 x 7 H 2 O 185 Fe-EDTA 5 мл из 100 -x MS B 5 -витамины 1 мл из 1000 -x стока B 5 микросоли 1 мл из 1000 -x стока Мальтоза 90 000 МЕС буфер 1950 Глютамин 500 p. H=6, 2

1 2 Рисунок 5. 1 - диплоид, 2 – гаплоид

1 этап – Сбор и подготовка колосьев на стадии незрелых соцветий: отбор растений в поздней одноядерной стадии развития микроспор, предобработка изолированных колосьев низкими температурами при +4°+5°C в течение 2128 суток. 2 этап - Выделение и обработка пыльников: стерилизация колосьев, выделение пыльников на жидкую питательную среду В. Цитологический анализ. 3 этап – Изолирование и очищение микроспор: гомогенизация (300 об/мин х 90 сек), фильтрация, центрифугирование (900 об/м х 3 мин), флотирование интактных клеток в градиенте 20% мальтозы, центрифугирование (850 об/м х 5 мин), смешивание фракции микроспор со средой. Инкубирование эксплантов в темноте 28 дней при 25°C.

4 этап – Деление микроспор и разбавление культуральной среды: после 1 -ой недели микроспоры начинают делиться и образуют колонии, каллусы и эмбриоиды. В чашки Петри добавляют среды А с уменьшенным содержанием мальтозы (20 мг/л). 5 этап - Регенерация и укоренение: пассирование эмбриоидоподобных структур на твердую регенерационную среду (MS соли + витамины + 0, 1 мг/л зеатина + 0, 01 мг/л гибберелловой кислоты). Через 3 -4 недели образовавшиеся растения-регенеранты переносятся на среду для укоренения (1/2 MS соли + витамины + 15 г/л сахарозы). 6 этап – Удвоение хромосом. Контроль уровня плоидности. Пересадка в грунт, опрыскивание раствором ГК. Получение семенного материала. Кариологический и биохимический контроль полученных дигаплоидов.

Методика проведения НИР Приготовление питательных сред и стерилизации материала, инструментов по Ф. Л. Калинину и др. , 1980. - Выделение микроспоры и получение гаплоидов ячменя по методам гаплоидной технологии по А. М. Тураеву и др. , 1990; АЦФГР, 1997. - Цитоэмбриологические анализы по методике З. П. Паушевой, 1974. - Статистическая обработка – В. П. Доспехов 1987; -

ОБЪЕМЫ РАБОТ - Выращивание донорных растений; - Сбор и подготовка колосьев на стадии незрелых соцветий; - Воздействие холодом (холодовой стресс) пыльников; - Стерилизация колосьев; - Выделение пыльников в асептических условиях; - Подготовка питательных сред; - Изолирование и очищение микроспор; - Наблюдения за делением микроспор; - Перенос эмбриоидоподобных структур на твердую регенерационную среду; - Колхицинирование гаплоидных растений ячменя; - Высадка регенерантов в грунт.

План пропаганды научных достижений 1. Заявление на патент РК на изобретение в РГКП «НИИС» “Способ создания генетически однородных и стабильных дигаплоидных генотипов ячменя на основе культуры изолированных микроспор. ” Регистрационный № 2013/0085. 1 от 29. 01. 13. Башабаева Б. М. , Абугалиева А. И. , Исмагул А. Ж. 2. Башабаева Б. М. А. Ж. Исмагул, А. И. Абугалиева, Б. Ш. Алимгазинова, Б. С. Сариев. Культура изолированных микроспор в создании генетически однородных и стабильных дигаплоидных генотипов ячменя //Биотехнология. Теория и практика. Май. 2013.

СПАСИБО ЗА В Н И М А Н И Е!