Метод электронного парамагнитного резонанса в исследованиях свойств биосистем

Метод электронного парамагнитного резонанса в исследованиях свойств биосистем Спектрометр ЭПР ВИГТ.421400.012 Рабочая частота - 9,3 … 9,6ГГц СВЧ-генератор - волноводной конструкции, выполнен на диоде Ганна.

Метод ЭПР является основным методом для изучения парамагнитных частиц присутствующих в биологических системах. Метод ЭПР был открыт в 1944 г. в Казанском Университете Евгением Константиновичем ЗАВОЙСКИМ при исследовании поглощения электромагнитной энергии парамагнитными солями металлов. Позволяет избирательно детектировать и изучать электронное строение различных парамагнитных частиц. Современные спектрометры позволяют изучать парамагнитные молекулы непосредственно в процессе функционирования нативных биологических систем Можно изучать даже небольших животных помещенных в специально сконструированный резонатор спектрометра Позволяет обнаруживать неспаренные электроны при низкой их концентрации (10-5 М) в любом веществе, не разрушая и не видоизменяя его. Методом ЭПР можно определять концентрацию и идентифицировать парамагнитные частицы в любом агрегатном состоянии, что незаменимо для исследования кинетики и механизма процессов, происходящих с их участием

Метод накопления

Индукция магнитного поля лежит в диапазоне (0,34-1,25 Т) 9,5 ГГц (X-полоса) ведется с растворами и при изучении систем, не требующих очень высокого разрешения спектров 25ГГц (K-полоса) 35 ГГц (Q-полоса)

Орбитальные механический и магнитный моменты электрона Орбитальный момент количества движения электрона Р по орбите радиуса R равен (1) где m- масса электрона, v - его скорость Орбитальному механическому моменту соответствует орбитальный магнитный момент (2) где I - сила тока в контуре, а S - площадь контура С другой стороны, из атомной физики известно, что орбитальный механический момент выражается через орбитальное квантовое число следующим образом (3) n - орбитальное квантовое число, принимающее значения 0, 1, 2 и т.д Тогда магнитный орбитальный момент будет выглядеть (4) S = πR2 где e - заряд электрона

Спиновые механический и магнитный моменты Спиновый магнитный момент электрона связан со спиновым движением электрона, которое можно представить, как движение вокруг собственной оси. Спиновый механический момент электрона равен где S - спиновое квантовое число равное ½ Магнитный и механический спиновые моменты связаны соотношением где MS - магнитное квантовое число равное +1/2 В большинстве случаев орбитальный магнитный момент равен нулю (L=0) поэтому при обсуждении принципа метода ЭПР рассматривается только спиновый магнитный момент

Магнетон Бора Для n=1 величина μ называется магнетоном Бора и является единичным магнитным моментом. Эта величина равна 9,27*10-21 Дж/м*Тл (5) Гиромагнитное отношение (γ) Отношение магнитного момента к механическому называется гиромагнитным отношением (g) Для орбитального Для спинового g - фактор Для гиромагнитного отношения электронов, имеющих различный вклад орбитального и спинового движения, вводят коэффициент пропорциональности g, такой, что Этот коэффициент пропорциональности называется g-фактором. когда отсутствует спиновое движение электрона и существует только орбитальное g=1 (S=0) если отсутствует орбитальное движение и существует только спиновое (например, для свободного электрона) g=2 (L=0) Формула Ланде 1 < g < 2 Если свободный атом содержит несколько электронов, то их орбитальные и спиновые моменты складываются В этом случае магнитные свойства атома будут определяться значениями квантовых чисел L (суммарный орбитальный момент) и S (суммарный спиновый момент), а также полным квантовым числом J.

эффект Зеемана Распределение Больцмана Парамагнитные частицы могут обмениваться энергией друг с другом и взаимодействовать с окружающими их атомами и молекулами. (в кристаллах спины передают свою энергию кристаллической решетке) благодаря быстрой безызлучательной релаксации спинов в системе успевают восстановиться практическое равновесное отношение заселенности зееменовских подуровней N2/N1 < 1 Явление магнитной релаксации

Характеристики спектров ЭПР Амплидута сигнала Площадь под кривой поглощения пропорциональна, при прочих равных условиях, количеству парамагнитных частиц в образце Общепринятым стандартом для таких измерений является дифенил-пикрилгидразил (C6H5)2N-N-C6H5(NO2)3, который на 100% состоит из радикалов (неспаренных электронов на 1 г вещества) Форма линии Функция Лоренца Ширина спектра ЭПР зависит от взаимодействия магнитного момента электрона с магнитными моментами окружающих ядер (решетки) и электронов Механизм релаксации заключается в передаче кванта электромагнитной энергии решетке или окружающим электронам и возвращении электрона на низкоэнергетический уровень Позволяет судить о реальных взаимодействиях, которые испытывает неспаренный электрон и которые приводят к неизбежному «размазыванию» его энергии. Ширина линии Величина Т1 называется временем спин-решеточной релаксации (взаимодействия магнитного момента неспаренного электрона с решеткой ) и характеризует среднее время жизни спинового состояния Величина Т2 называется временем спин-спиновой релаксации (взаимодействия магнитного момента неспаренного электрона с магнитными моментами других электронов) Это взаимодействие приводит к уменьшению времени релаксации и тем самым к уширению линии спектра ЭПР

Тонкая структура спектров ЭПР Сверхонкая структура спектров ЭПР Вместо синглетной линии электронного поглощения возникнет (2I+1) линий равной интенсивности. Полученная информация широко используется для определения значений ядерных спинов. Имея спектры с эталонной сверхтонкой структурой, можно проводить качественный и количественный анализ спектров исследуемых веществ. Mn55 I=5/3 6 линий Cu63 Cu65 I=3/2 4 линии Для биохимика непосредственный интерес представляет фактическая величина расщепления между сверхтонкими компонентами и характер ее изменения с изменением угла. Позволяет идентифицировать активный центр исследуемого соединения, установить природу химической связи, потенциальную активность различных групп, охватываемых орбиталью неспаренного электрона.

Сигналы ЭПР наблюдаемые в биологических системах Спектр ЭПР печени крысы Спектры ЭПР УФ-облученного цистеина Формула спинового зонда ТЕМПО и его спектр ЭПР. В этом радикале неспаренный электрон локализован около ядра азота, магнитное поле которого накладывается на внешнее магнитное поле.

Двойной электронно-ядерный резонанс (ДЭЯР) (самостоятельный разбор) ___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________