Метилирование ДНК подходы к анализу Метилирование ДНК

Метилирование ДНК: подходы к анализу

Метилирование ДНК как инструмент исследования и средство терапии – общие соображения: ДНК-метилирование – широко распространенный, но не универсальный долгосрочный механизм регуляции экспрессии У эукариот - всегда в комбинации с другими эпигенетическими механизмами Специфическое воздействие in vivo на современном методологическом уровне затруднительно Ряд патологий вызван нарушением ДНК-метилирования Паттерны метилирования содержат большое количество диагностических маркеров (уже известных и еще не выявленных) Патологии, связанные с аберрантными профилями метилирования, могут быть скорректированы, но перспективы отдаленные

Анализ метилирования ДНК: подходы Глобальная оценка уровней метилирования (в масштабе генома, отдельных хромосом или их фрагментов) Детекция метилированных цитозинов in situ (антитела, MBD белки) Картирование позиций метилирования с использованием метилчувствительных эндонуклеаз рестрикции Бисульфитная модификация Секвенирование Большинство методов предполагает обогащение препарата фракцией метилированной ДНК, в основе большинства современных методов – бисульфитная модификация

Анализ метилирования ДНК Подход зависит от цели исследования Глобальное или локус-специфичное метилирование? специфичное глобальное Cytosine Extension Assay поиск по геному или есть ген-кандидат? Параллельное бисульфитное секвенирование повторов есть ген-кандидат количественный или чувствительный анализ? Methyl Acceptance Assay количественный анализ HPLC поиск по геному клональное бисульфитное секвенирование Methy. Light MSP HRM (High Resolution Melting) аллель-специфичный? да Methy. Light MSP GOOD чувствительный анализ нет прямое бисульфитное секвенирование

Анализ метилирования ДНК Подход зависит от цели исследования поиск по геному Оценка локус-специфичного метилирования ДНК в масштабе генома С применением Arrays? да Связывание 5 m. Cспецифичных антител (Me(thy)DIP) Метил-чувствительная рестрикция Параллельное бисульфитное секвенирование нет RGLS (Restriction Landmark Genome Scanning) “Цифровое кариотипирование” (Digital Karyotyping) Создание библиотек и секвенирование

Глобальное метилирование ДНК: визуализация HPLC (high performance(pressure) liquid chromatography) первый классический метод: расщепление ДНКазой, обработка щелочной фосфатазой, очистка от РНК и разделение фракций, состоящих из отдельных нуклеотидов (1970 е-1980 е гг. ) (+) количественный и воспроизводимый (-) требует значительных количеств ДНК (до 50 мкг, новейшие модификации 5 -10 мкг) (-) трудоемкость (-) нет возможности получать информацию о метилировании отдельных локусов Реакция с хлорацетальдегидом Кислотная депуринизация ДНК, удаление пуринов (например, колоночной хроматографией), затем реакция с бисульфитом натрия и инкубация с хлорацетальдегидом. Из m 5 C при этом получается флуоресцентное производное (Oakeley et al. , 1999), количество которого может быть оценено и пропорционально содержанию m 5 C (+) простота процедуры (-) длительность, узкое место – удаление пуринов (d. A может дать флуоресцентный продукт)

Глобальное метилирование ДНК: визуализация Использование моноклональных антител к m 5 C иммобилизация денатурированной ДНК на твердую фазу и инкубация с антителами, конъюгированными с флуоресцентными производными, затем оценка интенсивности по сравнению с контролем, нормированная, например, на интенсивность окрашивания бромистым этидием Southern-blotting расщепление рестриктазами, чувствительными к метилированию, и последующий блоттинг с зондами на повторенные последовательности Методы, использующие ПЦР (включая секвенирование) оценка глобального уровня метилирования, если амплифицируются высокоповторяющиеся элементы (Alu, LINE) (+) сниженные требования к количеству и качеству анализируемой ДНК Более актуально для оценки специфичного метилирования

Анализ метилирования ДНК Me(thyl)DIP (Methylated DNA immunoprecipitation) Me(thyl)DIP Используются антитела к 5 -метилцитозину, связанные с ними фрагменты ДНК иммунопреципитируются на чип. Требуется много ДНК и антител Контрольная порция ДНК метится флуоресцентным красителем CY 5, иммунопреципитированная – красителем CY 3 Изначально разработан (компания Affymetrix) для сравнительной оценки общего уровня метилирования, но в комбинации с другими методами может использоваться для получения информации о локальном статусе метилирования Me. DIP-chip и Me. DIP-seq

Анализ метилирования ДНК Метод “ДНК-комет” – анализ метилирования в отдельных клетках (адаптация) K Лизис клеток в геле (как правило, щелочные условия), получение нуклеоидов (соль+детергент) Гидролиз ДНК метилчувствительными рестриктазами или их комбинациями 200 х увеличение Msp. I Электрофорез, Et. Br, микроскопия Hpa. II (метилчувствительная)

Анализ метилирования ДНК Использование метилчувствительных рестриктаз: либо не расщепляют метилированный сайт (Hpa II), либо расщепляют только метилированный сайт (Mte I) Мe CCGG GGCC Мe CCGG GGCC капиллярный электрофорез Мe CCGG GGCC Msp. I Мe блоттинг etc Hpa II, Msp. I Hpa II Msp. I Мe Pu. CGPy Py. GCPu Gla. I Мe Для “грубого” анализа распределения метилированных Cp. G можно использовать параллельное расщепление геномной ДНК чувствительными и нечувствительными к метилированию рестриктазами

Анализ метилирования ДНК Cytosine Extension Assay Мe CCGG GGCC C GGC CGG C Мe CGG C CCGG GGCC C GGC CGG C Мe C GGC ДНК-полимераза, (3 H)d. CTP Оценка количества включенной метки или радиоавтографический анализ профилей рестрикции (сравнение между пробами ДНК из разных тканей, органов и пр. )

Анализ метилирования ДНК Использование метилчувствительных рестриктаз Мe CCGG GGCC C GGC CGG C Мe CCGG GGCC CGG C CCGG GGCC C GGC CGG C C GGC Мe C GGC ДНК-лигаза олигонуклеотидные адапторы Мe C CGG GGC C CCGG GGCC C CGG GGC C Мe Возможно клонирование только фрагментов, выщепленных метилчувствительными рестриктазами, или рестрикционный анализ после бисульфитной модификации в случае, если бисульфитная модификация приводит к исчезновению или появлению сайта рестриктазы ПЦР C CGG GGC C

Анализ метилирования ДНК Модификация бисульфитом Na: превращение неметилированного цитозина в урацил Метилированный аллель Неметилированный аллель Секвенирование (сравниваем модифицированную последовательность с немодифицированной) или ПЦР

Различия в метилировании специфического локуса могут быть не только качественными, но и количественными Аберрантное метилирование в промоторе локуса h. Mlh 1 (фермент репарации) в опухолях толстой кишки с микросателлитной нестабильностью (Li et al. , Oncogene 2002) ДНК, выделенная из опухоли ДНК, выделенная из нормальной прилежащей ткани

Анализ метилирования ДНК Methyl Acceptance Assay Геномная ДНК метилируется in vitro метилазой (например, Sss. I CG methylase) с использованием радиоактивно-меченого SAM в качестве донора метильной группы me me me -GGCGACTGCGATGCCATGCGTT-CCGCTGACGCTACGGTACGCAA- me me me Используется для сравнительной оценки общего уровня метилирования

Restriction Landmark Genomic Scanning (RLGS) Анализ профилей метилирования тысяч локусов одновременно Анализ аберрантных профилей метилирования, делеций, амплификаций, изменения экспрессии при развитии, в т. ч. в масштабе генома При необходимости связать RLGS спот со специфической геномной последовательностью применяются специфические методы клонирования ("RLGS spot cloning”) Есть ограничения по чувствительности Гидролиз ДНК метилчувствительными рестриктазами (например, Not. I и Asc. I) Радиоактивное мечение (например, P 32), дополнительный гидролиз рестриктазами Двухмерный (2 D) электрофорез Сравнение радиоавтографов, анализ “спотов” (до тысяч на одном автографе)

Анализ метилирования ДНК: ПЦР При наличии “гена-кандидата” Количественный анализ: амплификация метилированных и неметилированных аллелей происходит с одинаковой эффективностью (требование одинаковой эффективности – ключевое требование количественного анализа метилирования!) уровень метилирования в локусе оценивается различными способами Мe Мe Мe Чувствительный анализ (MSP): амплификация метилированных и неметилированных аллелей происходит с разной эффективностью (праймеры перекрываются с позициями метилирования) чувствительность к метилированию может быть достигнута по-разному, но, как правило, используется бисульфитная модификация Мe Мe Мe

Анализ метилирования ДНК: ПЦР MSP (methyl specific PCR) После бисульфитной модификации проводится ПЦР с двумя наборами праймеров – один специфичен к модифицированной последовательности, другой – к немодифицированной me me -GGCGACTGCGATGCCATGCGTT-CCGCTGACGCTACGGTACGCAA- -GGUGAUTGCGATGUUATGCGTT-CUGUTGAUGCTAUGGTAUGCAA- ПЦР me me -GGCGACTGCGATGCCATGCGTT-CCGCTGACGCTACGGTACGCAA- -GGUGAUTGUGATGUUATGUGTT-CUGUTGAUGUTAUGGTAUGUAA- (+) высокая чувствительность: возможна детекция метилированного аллеля при 1000 кратном избытке неметилированного (0. 1%) (+) возможна полуколичественная оценка (real-time PCR), но нет надежных количественных методов (не метод выбора для количественных оценок уровня метилирования) (+) невысокие требования к количеству и качеству проб (-) анализ только полностью (не)метилированных аллелей, тогда как ситуация далеко не всегда такова (-) высокие требования к дизайну праймеров

Анализ метилирования ДНК: ПЦР MSP (methyl sensitive PCR) Может быть основана на использовании рестриктаз, чувствительных и нечувствительных к met 5 C Для анализа метилирования специфических последовательностей можно используют метилчувствительные рестриктазы, наиболее эффективными являются часто щепящие Hpa. II и Hha. I. , т. к. районы Cp. G-островков имеют множество сайтов их узнавания, что практически устраняет возможность неполного гидролиза ДНК Если фрагмент ДНК не содержит модифицированных оснований, то гидролиз проходит полностью, ПЦР не происходит Если в сайте узнавания рестриктазы вместо С присутствует met 5 C, гидролиз не происходит, можно выявить продукт ПЦР Достоинство – высокая аналитическая чувствительность (1 метилированная последовательность на 10000 неметилированных и более) Но не всякая последовательность подходит

Количественный анализ метилирования ДНК Southern-Blotting Бисульфитная модификация ДНК Перевод в оц. ДНК, пиросеквенирование (25 -30 н. ) Амплификация фрагмента ДНК Прямое секвенирование ампликона – усредненные данные о метилировании, количественная оценка на Phosphoroimager Клонирование, секвенирование клонов: каждый клон – отдельный аллель При достаточном количестве клонов – количественный анализ Аллель-специфичное бисульфитное секвенирование Расщепление рестриктазами по сайтам, чувствительным к модификации, количественная оценка при помощи электрофореза и денситометрии COBRA (combined bisulfite restriction analysis)

Количественный анализ метилирования ДНК Бисульфитное секвенирование с последующей массспектрометрией Бисульфитная модификация ДНК Амплификация фрагмента ДНК Перевод в оц. РНК при помощи полимеразы Т 7, расщепление эндонуклеазами разной специфичности Анализ паттернов расщепления (различны для метилированных и неметилированных позиций Cp. G) при помощи масс – спектрометрии

GOOD assay – чувствительный количественный метод анализа метилирования не требуется очистка пробы! 3’ часть каждого из праймеров содержит фосфоротиоатные звенья (до 3 х), а также (в некоторых приложениях) активные группы, способные изменять заряд Удлинение праймеров специальной полимеразой с использованием dd. NTP Расщепление щелочной фосфатазой, отщепляются немодифицированные части праймеров, отрицательный заряд фосфоротиоатов компенсируется реакцией алкилирования Tost et al. , NAR, 2003 Бисульфитная модификация ДНК, мультилокусная ПЦР

Количественный анализ метилирования ДНК Oligo arrays Бисульфитная модификация ДНК Амплификация специфичных фрагментов ДНК (до сотен и более) Гибридизация на Oligo Arrays с олигонуклеотидами, комплементарными определенным потенциально метилируемым позициям Количественный анализ метилирования в заданных позициях Основная сложность – дизайн праймеров Дифференциальная гибридизация Расщепление геномной ДНК метилнезависимыми рестриктазами Лигирование адапторов Расщепление ДНК метилчувствительными рестриктазами Амплификация неметилированных участков с праймерами к адаптору Мечение продуктов амплификации Гибридизация на Oligo Arrays MSNP (Affymetrix) – специфические SNP-чипы

Вариации, увеличивающие чувствительность анализа метилирования: Methylated Cp. G island recovery assay (MIRA) обогащение препарата Cp. G - островками за счет высокоаффинного связывания с комплексом MBD 2 b/MBD 3 L и последующей очистке на колонках (в основном для анализа метилирования в опухолях) Methylated Cp. G island amplification combined with microarray (MCA) используются метил-чувствительные и нечувствительные изошизомеры рестриктаз ДНК расщепляется метилчувствительной рестриктазой Sma. I, метилированная ДНК остается интактной, расщепленная удаляется затем эта ДНК расщепляется метилнечувствительной рестриктазой Xma. I к липким концам от Xma. I пришиваются адапторы, с праймеров к ним проводится ПЦР, меченые продукты гибридизуются с oligo arrays Sma. I CCCGGG GGGCCC Xma. I CCCGGG GGGCCC

Анализ метилирования ДНК: итоги Уже имеются и постоянно совершенствуются методы анализа метилирования, в т. ч. в масштабе генома Эти методы реализованы в технологиях, которые уже коммерчески доступны и постоянно дешевеют Основное прикладное применение знаний о метилировании в ближайшее время – диагностика рака и генетических нарушений, связанных с ним Перспективы использования в терапевтических целях – пищевые добавки, стимулирующие общее метилирование, ингибиторы метилаз и деметилаз в частных случаях терапии развивающихся опухолей Некоторые такие добавки (5 -Azacytidine, 5 -Aza-2’-deoxycytidine и др. )– на завершающих стадиях клинических испытаний (возможно, уже внедрены!) Проблема – плейотропные эффекты… 26

Анализ метилирования: мы живем в период первоначального накопления информации Не всегда понятно, что делать с накапливающейся информацией по позициям метилирования, их специфичности и консервативности – ее необходимо обрабатывать и определять биологические функции модификаций! 27

РНК-интерференция – перспективы практического применения 28

РНК-интерференция как инструмент исследования и средство терапии– общие соображения: РНК-интерференция – древний и консервативный механизм РНК-зависимого сайленсинга Может быть индуцирована практически у всех эукариот Может быть направлена на любой ген Может быть реализована в краткосрочном и долгосрочном вариантах Ряд патологий вызван нарушением природных механизмов РНК-интерференции и подлежит возможной коррекции Любая патология, связанная с нежелательной экспрессией специфической последовательности, в перспективе может быть скорректирована с использованием РНКинтерференции

Применение РНК-интерференции in vivo Достоинства: Высокая специфичность возможно специфическое подавление экспрессии аллеля, отличающегося от других вариантов одной нуклеотидной заменой! Универсальность подхода Небольшие затраты времени по сравнению с генным нокаутом Возможность гибкой регуляции Нет необходимости создания трансгенных линий Можно обойти развитие резистентности новый дизайн si. РНК в случае появления мутации резистентности Ограничения: Затухание сигнала (если не используется трансгенный подход) Стабильность сигнала Проблемы эффективной доставки в клетки и органы-мишени Неспецифические (off-target) эффекты Проблемы дизайна

Перспективы практического использования РНКi Генный нокдаун для “обратной генетики”: Исследования последствий “генного нокдауна” при помощи microarray и высокопроизводительного “next-generation” секвенирования Выявление функций новых идентифицированных генов Анализ возможных нецелевых эффектов медикаментов, основанных на подавлении экспрессии генов Идет работа интернационального коллектива над проектом: ми. РНК на каждый человеческий ген! Нокдаун последовательностей с известной функцией Нокдаун последовательностей с неизвестной функцией Исследование “генных сетей” Ashrafi et al. (2003) использовали BFL (Bacterial Feeding Library): скрининг по признаку избыточного накопления жиров - найдено 417 генов у С. elegans Многие из найденных генов консервативны – возможные мишени для терапии ожирения у человека (Tuschl, 2003)

Перспективы практического использования РНКi Генетическая терапия и генетическая “вакцинация”: Рак, вирусные и паразитарные инфекции Модуляция репликации ВИЧ-1 при помощи РНК-интерференции (Hannon, 2002) Мощное и специфическое ингибирование репликации ВИЧ-1 в культуре клеток при помощи РНК-интерференции (An et al. , 1999) Избирательный сайленсинг экспрессии вирусных генов в ВПЧ-положительных клетках цервикальной карциномы при обработке si. РНК (Jung et al. , 2002) Подавление мутированных аллелей и онкомаркеров включая сельское хозяйство… Контроль над паттернами развития, функционирования и формирования ЦНС (? !) Подавление нежелательной экспрессии Анализ и предсказание побочных эффектов Анализ и преодоление резистентности

Задачи, которые приходится решать: Определение (или выбор) доступной мишени Валидация мишени Выбор способа индукции Дизайн Обеспечение стабильности Синтез Трансформация, адресная доставка Контроль целевых и нецелевых эффектов Коррекция на всех стадиях Биоинформационные задачи Предсказание неизвестных мишеней in vivo Дизайн искусственных мишеней – новых или аналогов природных

Для выявления микро. РНК, их генов и их мишеней используют три основных подхода: Прямой биохимический метод – очистка комплексов RISC и последующий microarray-анализ связанных mi. РНК Разработка компьютерных алгоритмов предсказания а) мишеней для известных mi. РНК и б) mi. РНК для известных мишеней, исходя из закономерностей, следующих из накапливающейся информации о принципах взаимодействия mi. РНК–м. РНК Методика для предсказания mi. РНК: Mi. Rscan (Lim et al. , 2003) Методика для предсказания мишеней mi. РНК у позвоночных Target. Scan (Lewis et al. , Cell 2003) http: //genes. mit. edu/targetscan База для регистрации mi. РНК на Rfam http: //www. sanger. ac. uk/Software/Rfam/ имеется доступная база данных для mi. РНК (Griffiths-Jones, 2004, 2005) Регистрация и измерение изменений содержания м. РНК-мишеней при добавлении экзогенных дц. РНК-индукторов

Идентификация генов mi. РНК в геномах Идентифицированы сотни (в основном гены “классических” mi. РНК), но для большинства объектов это лишь меньшая часть из предсказанных Клонирование и секвенирование, затем экспериментальное подтверждение биологической активности (валидация) Проблема точного предсказания мишеней еще далеко не решена, в особенности у животных (неполная комплементарность с мишенью), многие предсказанные мишени не проходят валидацию Многие высоко консервативны, особенно 5’ конец, консервативные сайты связывания часто располагаются в 3’ UTR Критерии для валидации предполагаемой mi. РНК (Experimental Validation of mi. RNA Targets, Donald E. Kuhn et al. 2008) 1) 2) 3) Подтверждение взаимодействия mi. РНК и м. РНК-мишени Подтверждение коэкспрессии mi. РНК и м. РНК-мишени mi. РНК должна оказывать предсказуемый эффект на экспрессию белка, соответствующего мишени, ее подавление (например, с помощью ASO) должно восстанавливать уровень экспреcсии (сложность!) 4) Эффекты регуляции с участием mi. РНК должны быть равноценны эффектам от изменения биологической функции по другим причинам

Дизайн, способы получения и доставки дц. РНК для РНКинтерференции

Дизайн si. РНК – эмпирические правила Дуплекс 19 пн 3’ оверхэнг 2 н. Смысловая цепь Антисмысловая цепь 3’ концевая ОН- группа, 5’ концевая фосфатная группа Смысловая цепь: U в 10 й позиции, G/C на 5' конце (препятствует встройке смысловой цепи в RISC) Антисмысловая цепь: A/U на 5' конце, как минимум 5 A/U остатков на 5' –концевой трети Средняя треть: низкая стабильность (способствует расщеплению мишени и высвобождению “заряженного” RISC Отсутствие GC стретчей более 3 н. , АТ стретчей более 4 н. Избегать участков интронов и UTRs, участков >50% GC, стабильных вторичных структур, расстояние 50 -100 н. downstream от старт-кодона, если мишень в orf 37 Ui-Tei et al, Nucleic Acids Research, 2004 и др.

Ограничения применения РНК-интерференции 1. Позиционные эффекты – одни мишени лучше других 2. Угасание активности si. РНК – обычно за несколько дней после трансфекции 3. Кросс-реактивность за счет гомологии с другими мишенями 4. Активность блокируется за счет конкуренции с другими si. РНК 5. Некоторые si. РНК высоко устойчивы к химическим модификациям, другие - нет 6. Различная толерантность к мутациям в мишени 7. Различная изменчивость мишеней 8. (Основная проблема в настоящее время) – доставка в клетки in vitro и in vivo 9. Некоторые si. РНК и их предшественники запускают интерфероновый ответ у млекопитающих 38

Индукция РНК-интерференции в клетках млекопитающих Other genes possibly targeted by lamin. B 2 Длинные дц. РНК, доставляемые при помощи векторов в ядро (в цитоплазме могут запустить PKR), эффективнее коротких: Нет кэпа и нет poly. A – не выводятся в цитоплазму, а расщепляются в ядре на si. РНК Несколько разных si. РНК на одну мишень м. РНК Эффективность сайленсинга выше, но возможны проблемы со специфичностью… Harborth et al, JCS, 2001 Эффективность сайленсинга зависит от стратегии доставки CLSTN 2 5'-AAGAGGAGGAAGAAGCCGAGG-3' ||||| 3'-UUCUCCUCCUCCUUCGGCUCA-5' HS 6 ST 3 5'-AAGAGGAGGAGGAAGACGAGC-3' |||||||| 3'-UUCUCCUCCUCCUUCGGCUCA-5' NM_015897 5'-AAGAGGAGGAGGAAGACGAGG-3' |||||||| 3'-UUCUCCUCCUCCUUCGGCUCA-5' NM_015355 5'-ACUCGGCCUCCUCCU-3' ||||||||||| | 3'-UGAGCCGAAGGAGGAGGAGAA-5' ATBF 1 5'-AAGAGGAGGAGGAAGACGAGG-3' |||||||| 3'-UUCUCCUCCUCCUUCGGCUCA-5' SPTB 5'-AAGAGGAGGAGGAAACAGAGU-3' ||||||| | |||| 3'-UUCUCCUCCUCCUUCGGCUCA-5' 39

Позиционный эффект может быть вызван связыванием м. РНК с белками или наличием вторичных структур, препятствующих посадке RISC TF-luciferase-reporter assay Holen et al, NAR 2002 TF (47 -951) Мишени для РНКi на м. РНК гриппа Ge, 2003 LUC (37 -2255) Normalised TF-LUC/RLUC . . . Не всякий участок РНК может быть мишенью для РНКi!

Способы получения дц. РНК: Химический синтез (в основном твердофазный) Ферментативный синтез (в основном транскрипция in vitro фаговыми РНКполимеразами, например, Т 7) Ферментативный гидролиз длинных дц. РНК (РНКаза. III/DICER) Внутриклеточная экспрессия с помощью векторов (плазмиды, вирусы) Суспензионные клеточные культуры (через ретровирусные копии) Дорого, неспецифично, недолговременный эффект, отсутствие амплификации в клетках млекопитающих Коммерческая доступность Простота дизайна системы, возможность скрининга, масштабирования, мечения Нет необходимости работать с РНК Нет возможности прямого мечения наиболее употребимы сейчас ближайшие перспективы

Способы получения дц. РНК: ü Химический синтез ü Транскрипция in vitro (ниже выход, но возможно производство “in house”) Необходимость выбора участка мишени vs ü Гидролиз длинных дц. РНК (РНКаза. III/DICER) (“коктейли si. РНК”) Доступен рекомбинантный Dicer для расщепления дц. РНК in vitro Нет необходимости выбора участка мишени! Высокий риск неспецифичных (off-target) эффектов Низкая эффективная концентрация “правильной” si. РНК

Способ индукции РНКi зависит от объекта исследования! Кормление бактериями – продуцентами дц. РНК С. elegans Вымачивание в растворе дц. РНК Инъекция дц. РНК Drosophila Трансгенез (введение конструкции, транскрибирующейся с образованием РНК-шпильки или дц. РНК) ЭСК, ооциты, ранние эмбрионы Трансфекция дц. РНК (в т. ч. липид-опосредованная) Трансфекция синтетической si. РНК Дифференцированные клетки в культуре, взрослые организмы in vivo Растения Трансфекция плазмидой, транскрибирующейся с образованием РНК-шпильки Оверэкспрессия комплементарной оц. РНК трансгена или вирусного вектора (через механизм ко-супрессии)

Доставка дц. РНК в клетки/ткани Трансфекция (пик эффекта через 2 -3 дня, продолжительность до недели) Химическая трансфекция с помощью липосом на основе катионных липидов (Lipofectamine, Oligofectamine, Siport и пр. ), а также с помощью фосфата кальция РНК заряжена отрицательно и отталкивается от головок липидов клеточной мембраны проблемы – низкая эффективность, особенно in vivo, возможная цитотоксичность в некоторых случаях эффективна пришивка гидрофобных соединений непосредственно к дц. РНК (холестерол), PEGилирование Использование CPPs (cationic cell-penetrating peptides) (transportan, penetratin) Электропорация (в т. ч. электропорация паразитов) Образование гидрофильных пор при сильном электрическом разряде Эффективна не для всех типов клеток, высокий процент гибели клеток Векторы: плазмидные векторы, вирусы +in vivo: Внутримышечные инъекции Гидродинамическая трансфекция в клетки млекопитающих

Непосредственное использование дц. РНК для индукции РНКi Плюсы (по сравнению с использованием векторов) : ü Быстрый метод ü Универсальность ü Низкие трудозатраты на дизайн ü Возможна стабилизация за счет модификаций ü Снижение риска мутагенных и иммуногенных эффектов Минусы: ü Нестабильность эффекта (зависит от частоты деления клеток) ü Невозможность индукции ü Трудность тканеспецифичного генного нокдауна Чтобы достичь более чем 90% ингибирования экспрессии мишени, вводимая si. РНК должна оставаться эффективной в течение периода, равного тройному времени полужизни соответствующего белкового продукта гена-мишени! 45

дц. РНК и так относительно стабильны, но можно дополнительно увеличить их стабильность! Полная замена одной цепи на ДНК инактивирует si. РНК, но до 8 дезоксирибонуклеотидных остатков на цепь допустимо Мутации, альтернативные основания, химические модификации Стабильность может изменяться в 10 раз и более (время полужизни меняется от минут до часов) Kim, Rossi Nature Reviews Genetics 2007 Химические модификации si. РНК

Векторы для экспрессии si. РНК Векторы на основе плазмид ü Транзиентный (преходящий) характер трансфекции ü Низкая и непостоянная эффективность трансфекции Плазмидные векторы с промотором к Pol II ü Тканеспецифичные Большинство доступных на рынке векторов используют промоторные районы Pol III, плазмидные векторы на основе промоторов Pol II – новый тренд Pol III активна во всех клетках тела, Pol II нет – возможен специфический сайленсинг Векторы на основе вирусов ü Высоко эффективны для большинства типов клеток ü Ретровирусы – только для делящихся клеток ü Небезопасны (случай смерти пациента, инъецированного аденовирусом) ü Аденовирусы – нестабильная экспрессия human lentiviral sh. RNA library: 15, 000 http: //www. openbiosystems. com/

Варианты плазмидных векторов для экспрессии si. РНК ТТТТТТ Петля Drosha Dicer ТТТТТТ Dicer Промотор для Pol III (CMV, H 1 или U 6) ТТТТТТ Терминатор для Pol III 48 ТТТТТТ

Лентивирусные конструкции для доставки si. РНК: Можно внести много “постороннего” генетического материала HIV packing signal CMV promoter Woodchuck hepatitis Promoter Virus response control purine track element Selfinactivating long terminal repeats Rubinson et al Nature Genetics, 2003 Экспрессируют РНК-шпильку Возможность добиться наследуемого стабильного эффекта у млекопитающих Могут реплицироваться в неделящихся клетках Особенно актуальна для доставки в клетки нервной системы И не только Доставка si. РНК при помощи лентивирусов An et al, Human Gene Therapy 2003 Stewart et al, RNA 2003 Paddison PJ et al. Nature 2004

Доставка si. РНК в клетки: использование наночастиц и “полиплексов” с дополнительными функциями Nonviral delivery of synthetic si. RNAs in vivo. Akhtar S. , Benter I. F. The Journal of Clinical Investigation, 2007 Рецептор-зависимая доставка si. РНК в ткани мыши при помощи “полиплексов” с поликатионным каркасом

Малые регуляторные эндогенные РНК – объект диагностики и терапии “mi. RNAs might have a general role in regulating gene expression in diverse developmental and physiological processes, and (there are) substantial hints that mis-regulation of mi. RNA function might contribute to human disease” He and Hannon, 2004

Микро. РНК и болезни Повышенная экспрессия предшественника 155/BIC RNA – лимфома Беркетта Пониженная экспрессия Let 7 – низкая постоперационная выживаемость при раке легких Делеции и подавление экспрессии mi. R 15 и mi. R 16 – хроническая Вклеточная лимфоцитарная лейкемия (ассоциация в 68% случаев) Повышение экспрессии mi. R-10 b (х50) – повышенная способность к метастазированию при раке молочной железы (за счет подавления трансляции транскрипционного фактора Hox. D 10, ответственного за блокирование экспрессии генов, участвующих в метастазировании) Индукция экспреcсии этой mi. РНК со встроенных трансгенных копий ведет к метастазированию! Экспрессия вирусных mi. РНК – подавление трансляции клетки-хозяина Пример: mi. РНК к вирусной м. РНК гена Nef, вырабатываемая клетками, пораженными HIV-1, может подавлять транскрипцию вируса (Omota et al. , Retrovirology 2004), и в то же время mi. РНК, вырабатываемые самим HIV-1, могут подавлять трансляцию в клетках хозяина

Мутации в участках геномной ДНК, отвечающих за синтез mi. РНК, снижение экспрессии которых типично для опухоли, могут приводить к снижению активности mi. РНК mi. R-16 -1 – одна из двух расположенных в кластере mi. РНК – индукторов апоптоза Непосредственная мишень – м. РНК гена Bcl-2 (доказано с помощью репортерных конструкций) Мутации в этом кластере mi. РНК, как и его делеция, препятствуют этой активности Белок Bcl-2 подавляет апоптоз (участвует в регуляции проницаемости внешней митохондриальной мембраны) Содержание Bcl-2 увеличено во многих образцах CLL (с делециями кластера mi. РНК) NEJM 2005

Мутации в участках геномной ДНК, отвечающих за синтез mi. РНК, снижение экспрессии которых типично для опухоли, могут приводить к снижению активности mi. РНК В пробах CLL (Chronic Lymphocytic Leukemia) секвенировали 42 гена mi. РНК (для которых ранее было показано изменение экспрессии проявлениях CLL) В 11 из 75 проб (15%) были выявлены мутации в участках, кодирующих mi. РНК. Все мутации пришлись на гены четырех mi. РНК: mi. R-16 -1, mi. R-27 b, mi. R-29 b-2, mi. R-187 Ни один из 160 доноров без проявлений CLL (контроль) не имел этих мутаций Из 11 доноров с мутациями 8 (73%) – 1 я стадия опухолеобразования, у семи – рак у близких родственников NEJM 2005

Профили экспрессии микро. РНК позволяют классифицировать раковые опухоли микро. РНК 334 образца опухолей человека Lu et al. Nature 2005 Проанализирован массив из 217 mi. РНК млекопитающих Показаны различия в экспрессии mi. РНК, дискриминирующие тип опухоли Отличия в основном заключались в снижении уровня тех или иных микро. РНК Дискриминация опухолей по ткани происхождения при помощи анализа профилей mi. РНК оказалась более эффективной, чем аналогичная дискриминация при помощи профилей м. РНК пробы (пациенты)

Микро. РНК и болезни: паркинсонизм Паркинсонизм связан с нехваткой дофамина в тканях черной субстанции (участок среднего мозга, участвующий в контроле выполнения произвольных движений) При болезни Паркинсона дофаминэргические нейроны черной субстанции отмирают и перестают вырабатывать дофамин -> останавливается передача сигнала нейронам полосатого тела Отмирание дофаминэргических нейронов может быть вызвано разными причинами (повышенный уровень оксидантов, действие токсинов). Одна из причин – недостаток специфической mi. РНК mi. R-133 b (показано на животных моделях) Крыса, страдающая болезнью Паркинсона (тремор конечностей, непроизвольные движения и все остальные симптомы) Концентрация mi. R-133 b в различных отделах мозга у больных паркинсонизмом (PD) и у здоровых людей (control) СХ — кора больших полушарий, МВ — средний мозг, СВ — мозжечок mi. R-133 b специфически связывается с ТФ Pitx 3, регулирующим созревание дофаминэргических нейронов В норме концентрация обеих молекул — mi. R-133 b и Pitx 3 —поддерживается на строго определенном уровне Существует обратная регуляторная петля mi. R-133 b и Pitx 3 mi. R 133 b Pitx 3 56

Гены микро. РНК Белок-кодирующие гены Точечные мутации Делеции и дупликации Изменения статуса транскрипции Регуляторные элементы (энхансеры, инсуляторы) Точечные мутации Делеции и дупликации Изменение концентрации mi. РНК некоторых РНК (онкомиры, oncomi. Rs) за счет мутаций и/или изменения статуса транскрипции может быть онкогенным. “Онкомиры” могут выступать как онкогены или опухолевые супрессоры Значимые изменения концентрации могут быть незначительны (менее, чем в 2 раза). Для того, чтобы достоверно выявлять такие изменения, нужны особые подходы Разрешение “классических” методов анализа экспрессии малых РНК (Northern blotting, Nuclease Protection Assay, Real-Time q. PCR, Micro. Arrays) может быть недостаточным

Количественный тест: измерение экспрессии при помощи количественной Real-time PCR mi. РНК RT праймер RT 1 шаг: Stem-loop RT RNAse. H 2 шаг: Real-Time PCR I Taq. Man t

“Цифровая” ПЦР Количественный анализ с детекцией по конечной точке! Амплификация каждой молекулы ДНК, изначально присутствующей в пробе, регистрируется независимо I Обычная ПЦР в реальном времени Цифровая ПЦР t

“Цифровая” ПЦР Количественный анализ с детекцией по конечной точке! Амплификация каждой молекулы ДНК, изначально присутствующей в пробе, регистрируется независимо 0 1 1 0 От 10000 до 10000000 независимых реакций в одном анализе

“RNAi drugs” 2001: Thomas Tuschl и соавторы показали, что малые синтетические РНК, введенные в человеческие клетки, могут подавлять экспрессию человеческих генов 2002: Mc. Сaffrey и соавторы успешно индуцировали РНК-интерференцию у взрослых мышей Основные идеи разработок: Характер признака, с которым связана патология Принципы терапии Вирусная инфекция Уничтожение вируса Уничтожение клеток, инфицированных вирусом Предотвращение возможности инфекции Усиление экспрессии регуляторных РНК Подавление экспрессии регуляторных РНК Уничтожение регуляторных РНК Уменьшение экспрессии регуляторных РНК Стимуляция экспрессии регуляторных РНК Введение регуляторных РНК или их аналогов Мутации в мишенях для регуляторных РНК или генах самих регуляторных РНК ? ? ?

“RNAi drugs” Почти все 2000 е годы – большие надежды! www. roche. com В стадии клинических испытаний В стадии доклинических испытаний Kim, Rossi Nat Rev Gen 2007 www. ambion. com Но… Drug giants turn their backs on RNA interference. Ledford, Nature 2010 Yet all that seemed like ancient history last week when drugs and diagnostics corporation Roche in Basel, Switzerland — a major investor in RNAi-based drug research — announced it was killing its programme after spending three years and more than $500 million on the technique …the three years Roche spent in the field hardly seems enough time to fully evaluate the technique, says Maraganore. "Three years is nothing, " he adds. "It's like kicking your three-year-old out of the house and telling him to get a job. "

Ген 5 Ген 1 Ген 3 Ген 4 Ген 7 Ген 6 Ген 8 Ген 2 Онкоген si. РНК

“RNAi drugs”: и все же…

Сельское хозяйство: с животными и растениями проще, чем с людьми Гавайская папайя была поражена PRV (Papaya Ringspot Virus). Не помогала ни селекция, ни какие-либо препараты, но помогло введение трансгенной конструкции, вызывающей РНК-интерференцию этого вируса генетически модифицированная папайя, пораженная вирусом Первые подходы к контролю количественных признаков! а также кофе с уменьшенным содержанием кофеина, зеленые розы и т. п.

Предварительные выводы: mi. РНК могут действовать, как опухолевые супрессоры или онкогены Типы опухолей могут различаться профилями экспрессии mi. РНК Мутации в участках генома, кодирующих mi. РНК или их мишени, могут приводить к разнообразным специфическим эффектам, в том числе и положительным Последовательности mi. РНК с мишенями в м. РНК онкогенов в будущем могут использоваться в терапевтических целях В настоящее время наиболее перcпективное направление РНКiтерапии – воздействие на вирусные РНК Разработка противораковых средств сталкивается с серьезными технологическими и “биоинформационными “ затруднениями, а результаты противоречивы

Практическое применение РНК-интерференции: итоги Ø РНК-интерференция – древний и консервативный механизм РНК-зависимого сайленсинга у эукариот. Может быть использован как техника обратимой инактивации практически любого гена! Ø Возможна краткосрочная и долгосрочная индукция Ø Возможно использование в диагностических целях (анализ профилей экспрессии) Ø Возможно использование в терапевтических целях Ø Возможно использование для исследования роли генов с неизвестными функциями Ø Технология получила серьезное развитие Ø Ограничения – труднопредсказуемые побочные эффекты Ø Перспективы применения крайне широкие 67

Благодарю за внимание! 68