Медицинская генетика Практический курс Клиническая цитогенетика Кариотип человека

Медицинская генетика Практический курс Клиническая цитогенетика Кариотип человека в норме и при патологии

Клиническая цитогенетика – раздел медицинской генетики, изучающий связь изменений в кариотипе человека с патологией.

Цитогенетические методы используются для диагностики таких патологических состояний, как: Хромосомные болезни – врожденные наследственные этиологическими факторами которых являются геномные несбалансированные хромосомные мутации. заболевания, мутации и Некоторые онкологические заболевания, причиной которых являются хромосомные мутации (например, хронический миелолейкоз и филадельфийская хромосома). Моногенные наследственные заболевания, одним из проявлений которых является нестабильность хромосом (при синдроме Блума – увеличение частоты сестринских хроматидных обменов, при анемии Фанкони – повышенная ломкость хромосом).

Хромосомная болезнь – это изменение конституционального кариотипа человека, поскольку мутация возникает либо в гамете родителя, либо в раннем эмбриогенезе самого индивида. Таким образом, либо все клетки организма имеют аномальный кариотип, либо значительная часть клеток (так называемый генетический мозаик). В случае онкологического заболевания хромосомная мутация затрагивает только отдельные соматические клетки (соматическая мутация) и таким образом не приводит к конституциональному изменению кариотипа пациента.

Нормальный кариотип человека Кариотип – совокупность морфологических особенностей полного хромосомного набора, свойственного клеткам данного биологического вида. На какой стадии клеточного цикла хромосомы видны, как отдельные четко ограниченные структуры?

Методы получения препаратов митотических хромосом прямые непрямые

Прямые методы получения препаратов митотических хромосом • • • клетки костного мозга, селезёнки, кишечного эпителия, соединительной ткани, на эмбриональной стадии – клетки цитотрофобласта хориона или плаценты + не требуют длительного - низкий митотический индекс + не сопровождаются - сложные (травматичные) методы получения материала (пункция, биопсия) культивирования спонтанными изменениями кариотипов в исследуемых клетках

Непрямые методы получения препаратов митотических хромосом используют культуры клеток, стимулированных к делению in vitro • лимфоциты периферической крови, • амниоциты (на эмбриональной стадии развития), • фибробласты кожи Конституциональный кариотип человека (в постнатальный период) главным образом изучают по лимфоцитам периферической крови. + доступность получения материала для исследования, + кратковременность культивирования (48 -96 часов, стандартное время 72 часа), + простота методики + хорошая воспроизводимость результатов. -спонтанные изменениями кариотипа в отдельных клетках, -ложноположительные результаты -необходимость дополнительных исследований для исключения мозаицизма. Условия забора крови для цитогенетического исследования?

Забор крови для цитогенетического исследования выполняется с учетом двух обязательных условий: • Использование антикоагулянта (гепарина) для предотвращения свертывания крови; • Соблюдение стерильности для предотвращения последующего бактериального загрязнения культур клеток.

Фиксация клеток и получение препаратов метафазных хромосом. Накопление клеток на стадии метафазы (цитостатики - колхицин и колцемид). Гипотоническая обработка обеспечивает отделение хромосом друг от друга в процессе раскапывания клеток на стекла. Клетки и ядра значительно увеличиваются в объеме, цитоплазма разжижается, рвутся межхромосомные связи. Фиксация клеток с помощью фиксатора Карнуа (3: 1 метанол - ледяная уксусная кислота) Клеточную суспензию раскапывают на предметные стекла. При падении капли суспензии в фиксаторе на поверхность стекла происходит распластывание клеток и метафазных пластинок.

Денверско-Чикагская классификация хромосом человека (1960 -1966 г. ) Кариотип человека состоит из 46 хромосом: 44 – аутосомы (хромосомы, одинаковые у обоих полов) 2 – половые хромосомы (XX у женщин и XY у мужчин). 46, XX – формула женского кариотипа; 46, XY – формула мужского кариотипа кариограмма По какому принципу можно классифицировать хромосомы?

теломера Короткое плечо p (petite – fr. ) центромера Длинное плечо q теломера • хромосомы разбиты на группы по размеру и морфологии, • каждая группа имеет буквенное обозначение (от A до G). • аутосомы пронумерованы по убыванию длины (от 1 до 22).

метацентрические акроцентрические субметацентрические

Какие хромосомы можно отнести к каким типам?

Группа A: аутосомы 1, 3 (большие метацентрики), 2 (большой субметацентрик) Группа B: аутосомы 4 и 5 (большие субметацентрики) Группа С: аутосомы 6 – 12 и половая хромосома X (средние субметацентрики) Группа D: аутосомы 13, 14, 15 (большие акроцентрики) Группа E: аутосомы 16, 17, 18 (малые субметацентрики) Группа F: аутосомы 19 и 20 (малые метацентрики) Группа G: аутосомы 21, 22, половая хромосома Y (малые акроцентрики)

Парижская классификация хромосом человека (1971 – 2005) (An International System for Human Cytogenetic Nomenclature – ISCN) дифференциально окрашенные хромосомы

стандартные символы и обозначения позволяют описать конкретный локус генома идиограмма

Xp 21 Расшифруйте обозначение

Алгоритм записи конкретного локуса генома: Хромосома (номер аутосомы, X или Y) Плечо (p или q) Район (номер) Блок (номер) Подблок (номер) Например: 9 q 21 – хромосома 9, длинное плечо, второй район, первый блок (или первый блок второго района длинного плеча девятой хромосомы). Расшифруйте обозначение Xp 21

В современной номенклатуре для каждой хромосомы даны пять идеограмм, соответствующих картам разного уровня разрешения (определяется количеством блоков на гаплоидный набор). Карты более высокого уровня разрешения – 550 и 850 блоков на гаплоидный набор. Например: карта 550 блоков - 9 q 21. 3 - хромосома 9, длинное плечо, второй район, первый блок, третий подблок. карта 850 блоков - 9 q 21. 32 - отмечен второй подблок третьего подблока. При описании подблоков вводится разделительная точка после номера блока. Центромера обозначается как 10 (p 10 или q 10), то есть как нулевой блок первого района плеча. Для чего еще кроме описания расположения генов используются такие обозначения?

R G Типы дифференциального окрашивания Q

Типы дифференциального окрашивания Q G R T C

Полиморфизм хромосом человека У человека есть морфологически полиморфные участки хромосом, которые характеризуют индивидуальные особенности и могут быть отражены в формуле стандартной записи кариотипа. НЕ СТРУКТУРНЫЕ ПЕРЕСТРОЙКИ!!! На уровне хромосом полиморфизму подвержены • гетерохроматиновые блоки (h), • спутничные нити (stk), • спутники (s). На каких хромосомах находятся?

Конститутивный гетерохроматин – в прицентромерных районах всех хромосом, а также в проксимальной части длинных плеч хромосом 1, 9 и 16 и в дистальной части длинного плеча хромосомы Y. Спутничные нити и спутники – в коротких плечах акроцентрических аутосом человека (13, 14, 15, 21, 22).

46, ХХ, 1 qh+, 16 qh+ Как убедиться, что это гетерохроматин?

Окрашивание гетерохроматиновых районов (С-окрашивание) CBG (46, XY) QFH/MG (46, XY, 9 ph)

Как убедиться, что отсутствует только гетерохроматин и нет делеции значимого генетического материала?

14 pstk+ 14 ps+, 22 ps+

QFH Ag. NOR FISH

Общие принципы описания кариотипа При описании кариотипа в первую очередь записывают общее количество хромосом, включая половые хромосомы, затем через запятую дается описание половых хромосом. Аутосомы описываются только в случае их изменений. 46, XX – нормальный женский кариотип 46, XY – нормальный мужской кариотип

Обозначение полиморфных вариантов хромосом 16 qh+ increase in length of the heterochromatin on the long arm of chromosome 16 Yqh- decrease in length of the heterochromatin on the long arm of the Ychromosome 21 ps+ increase in length of the satellite on the short arm of chromosome 21 22 pstk+ increase in length of the satellite stalk on the short arm of chromosome 22 15 cenh+pat increase in length of the centromeric heterochromatin of the chromosome 15 inherited from the father 1 qh+, 13 cenh+, 22 ps+ increase in length of the heterochromatin on the long arm of chromosome 1, increase in length of the centromeric heterochromatin of the chromosome 13, increase in length of the satellite on the short arm of chromosome 22 15 cenh+pstk+ps+ increase in length of the centromeric heterochromatin of the chromosome, the satellite stalk, and the size of satellites on the same chromosome 15

Обозначение полиморфных вариантов хромосом Yqs satellites on the long arm of the Y chromosome 9 phqh heterochromatin in both the short and the long arms of chromosome 9 9 ph heterochromatin only in the short arm of chromosome 9 21 pss double satellites on the short arm of chromosome 21

Двойные спутники 22 22

Патология кариотипа человека • летальность • врожденные пороки развития до 70% оплодотворенных яйцеклеток гибнут за счет хромосомного дисбаланса. До имплантации, вероятно, гибнут около 30% эмбрионов. Чем раньше останавливается развитие эмбриона, тем выше вероятность хромосомного дисбаланса.

Частота хромосомных аномалий в спонтанных абортах и мертворождениях процент Все спонтанные аборты 50 До 12 недель 60 12 -20 ндель 20 Мертворожденные 5

Основные типы хромосомных аномалий в спонтанных абортах процент Трисомии 45, X Триплоидии Транслокации 52 18 17 2 -4

16 Частота трисомий в спонтанных абортусах Почему не встречается трисомий 1 и 19?

Частота хромосомных аномалий в популяции Хромосомные аномалии у новорожденных аномалии частота (на 1000 новорожденных) Все аномалии 9. 1 Трисомии по аутосомам 1. 4 Сбалансированные перестройки аутосом 5. 2 Несбалансированные аномалии аутосом 0. 6 Аномалии половых хромосом: у девочек у мальчиков 1. 2 0. 75 Какие хромосомные патологии встречаются среди живорожденных детей? Чем плохо быть носителем сбалансированной хромосомной перестройки?

Популяционная частота хромосомных болезней аномалии На 1000 новорожденных* Трисомия по 21 хромосоме 1. 5 Трисомия по 18 хромосоме 0. 12 Трисомия по 13 хромосоме 0. 07 47, XXY 1. 5 45, X 0. 4 47, XYY 1. 5 47, XXX 0. 65 *Пол учитывается только при аномалии, затрагивающей половые хромосомы

The main symbols and abbreviated terms used in the description of chromosomes and chromosome abnormalities acentric fragment ace additional material of unknown origin approximate sign (~) denotes intervals and boundaries of a chromosome segment arrow (→) from – to, in detailed system brackets, square ([ ]) surround number of cells centromere colon, single (: ) break, in detailed system colon, double (: : ) break and reunion, in detailed system comma (, ) separates chromosome numbers, sex chromosomes, and chromosome abnormalities decimal point (. ) denotes sub-bands deletion de novo designates a chromosome abnormality which has not been inherited derivative chromosome dicentric duplication endoreduplication fission, at the centromere fragile site h heterochromatin, constitutive i isochromosome idic isodicentric chromosome insertion inversion or inverted

mar marker chromosome maternal origin minus sign (-) loss mosaic multiplication sign (Ч) multiple copies of rearranged chromosome or alternative interpretation p short arm of chromosome parentheses ( ) surround structurally altered chromosomes and breakpoints paternal origin Ph Philadelphia chromosome plus sign (+) gain q long arm of chromosome question mark (? ) questionable identification of a chromosome or chromosome structure r ring chromosome robertsonian translocation s satellite semicolon (; ) separates altered chromosomes and breakpoints in structural rearrangements involving more than one chromosome slant line (/) separates clones stk satellite stalk t translocation telomere terminal (end of chromosome) upd uniparental disomy

Аномалии Численные хромосомные аномалии (Геномные мутации)* Кариотип Полиплоидия Триплоидия 69, XXX 69, XXY Анеуплоидия Трисомия 47, XX(XY), +21 Синдром Дауна 47, XX(XY), +18 Синдром Эдвардса 47, XX(XY), +13 Синдром Патау 47, XX(XY), +8 Трисомия по 8 47, XX(XY), +9 Трисомия по 9 47, XX(XY), +22 Триосмия по 22 47, XXY Синдром Клайнфельтера 47, XXX Triple X синдром 47, XYY Синдром дисомии по Y 48, XXXX Тетрасомия по Х Пентасомия по X Полисомия 49, XXXXX 48, XXXY Синдром Клайнфельтера 48, XXYY 49, XXXXY 49, XXXYY Моносомия 45, X Синдром Шерешевского. Тернера *только жизнеспособные Мозаицизм: например 47, XX(XY), +21/46, XX(XY) 47, XY, +8[53]/46, XY[37] 45, X/46, XX 45, X/46, XY 45, X/47, XXX/46, XX

3 n = 69, XXY

Трисомия по хромосоме 21 - синдром Дауна

Трисомия по хромосоме 21 - синдром Дауна 47, XX, + 21 47, XY, + 21 1 на 600

1 на 32

Синдром Дауна Цитогенетический: ~94% пациентов имеют по три копии хромосомны 21. Кариотип 47, XX(XY), +21 У ~2% пациентов часть клеток имеет три хромосомы 21, часть – две (мозаичный вариант). Кариотип 47, XX(XY), +21/46, XX(XY) ~4% транслокационный. Транслокация между хромосомой 21 и другой акроцентрической акросомой – 13, 14, 15, 21, 22). Кариотип 46, XX(XY), der(14; 21)(q 10; q 10), +21 Дополнительная хромосома 21: 95% материнское происхождение 5% нарушения в сперматогенезе

Транслокационный вариант синдрома Дауна Кариотип матери-носителя сбалансированной перестройки (транслокация 15 -21)

Риск рождения ребенка с синдромом Дауна в семьях с транслокационным вариантом синдрома Дауна Носитель транслокации Риск для потомства (%) der(14; 21) мать отец никто из родителей 10 2. 5 <1 der(21; 22) один из родителей как и для никто из родителей der(14; 21) низкий (менее < 1) der(21; 21) один из родителей 100 никто из родителей низкий (менее < 1) Тип транслокации

Трисомия 18 – синдром Эдвардса population frequency 1: 6500 47, XX, + 18 или 47, XY, +18

Edwards syndrome 47, XX, + 18

Трисомия 13 – Синдром Патау 47, XX, + 13 47, XY, + 13 population frequency 1: 7800

Трисомия 8 Contractions of interphalangeal joints 47, XY, + 8

Синдром Клайнфельтера 47, XXY Jacobs syndrome 47, XYY

Синдром Шерешевского-Тернера 45, Х 1: 2500 -1: 5000

normal monosony Х mosaicism Turner syndrome

Структурные хромосомные перестройки (Хромосомные мутации)* Сбалансированные инверсии транслокации 46, XX, inv(7)(p 11 q 11) 46, XY, inv(20)(p 11. 1 q 11. 2) Несбалансированные делеции 46, X, del(X)(p 21) 46, XX, del(4)(p 16) 46, XY, del(5)(p 15) 46, XX, del(5)(q 13 q 33) 46, X, r(X) 46, XX, dup(9)(p 11 p 24) 46, XX, t(1; 4)(q 42; q 21) 46, X, t(X; 6)(p 21; q 26) 46, X, t(Y; 5)(q 11; p 15) инсерции 46, XX, ins(2; 1)(q 31; q 25 q 42) дупликации робертсоновские транслокации 45, XX, der(14; 22)(q 10; q 10) 45, XY, der(14; 21)(q 10; q 10) 45, XX, der(13; 14)(q 10; q 10) изохромосомы 46, XY, i(18)(p 10) 46, X, i(X)(q 10) 46, XX, i(17)(q 10) *короткая система записи Длинная система записи: 46, XX, inv(7)(pter→p 11: : q 11→qter) 46, XX, t(1; 4)(1 pter→ 1 q 42: : 4 q 21→ 4 qter; 4 pter→ 4 q 21: : 1 q 42→ 1 qter) 46, XX, ins(2; 1)(2 pter→ 2 q 31: : 1 q 25→ 1 q 42: : 2 q 31→ 2 qter; 1 pter→ 1 q 25: : 1 q 42→ 1 qter) 45, XY, der(14; 21)(14 qter→ 14 q 10: : 21 q 10→ 21 qter) 46, X, del(X)(qter→p 21: ) 46, XX, dup(9)(qter→p 11: : p 24→pter)

Хромосомные перестройки Deletions 5 p-

Syndrome 4 p-

r(9)

ring chromosome- r(X) Turner syndrome (Vyatkina, 2004)

Isodicentric X der (X) - idic. Xq (Vyatkina, 2004)

Isochromosome i(Xq) (Vyatkina, 2004)

FISH

FISH - 3 basic steps 1. Denaturation 2. Hybridization 3. analysis

normal monosomy trisomy Balanced translocation FISH with centromeric DNA-probe normal deletion trisomy FISH with locus-specific DNA-probe Unbalanced translocation FISH with wholechromosome DNA-probe

He. La cells - Multicolour FISH (MFISH)

He. La cells - Multicolour FISH (MFISH)

Показания для цитогенетического обследования: Множественные врожденные пороки развития у новорожденного Умственная отсталость с сочетании с врожденными пороками развития или дисморфиями Нарушение полового развития Мужское и женское бесплодие Спонтанные аборты, мертворождения и рождение детей с пороками развития Оценка мутагенных воздействий