“Медицинская биология: Генетика” Практическое занятие 1. • Терминология. • Методы генетических исследований.
ПЛАН ЗАНЯТИЯ: 1. ПРЕДМЕТ ГЕНЕТИКИ И ЕЁ ЗАДАЧИ 2. ЭТАПЫ РАЗВИТИЯ ГЕНЕТИКИ 3. МЕТОДЫ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ 4. ГЕНЕТИКА И СОВРЕМЕННОЕ ЕСТЕСТВОЗНАНИЕ
ГЕНЕТИКА – наука о наследственности и изменчивости живых организмов. НАСЛЕДСТВЕННОСТЬ – свойство живых организмов передавать из поколения в поколение путем размножения биохимические и физиологические признаки. ИЗМЕНЧИВОСТЬ – свойство живых организмов отличаться от своих родителей.
Термин «ГЕНЕТИКА» ввел английский ученый Г. БЕТСОН в 1906 г. GENETICOS - по - древнегречески значит «относящийся к происхождению»
• • ЗАДАЧИ ГЕНЕТИКИ: 1) изучение механизмов хранения и передачи генетической информации от родительских форм к дочерним; 2) изучение механизма реализации информации в виде признаков и свойств организмов в процессе их индивидуального развития под контролем генов и влиянием условий внешней среды; 3) исследование типов, причин и механизмов изменчивости всех живых организмов; 4) исследование взаимосвязи процессов наследственности, изменчивости и отбора как движущих факторов эволюции органического
Актуальные задачи медицинской генетики • > изучение причин возникновения мутаций, приводящих к наследственным заболеваниям и аномалиям развития у человека (химические и физические факторы); • > поиск и разработка антимутагенных препаратов (предохраняющих от действия мутагенов); • > профилактика и лечение наследственных болезней человека (разработка методов диагностики и лечения); • > развитие медико-генетического консультирования, которое должно
ОБЪЕКТОМ ГЕНЕТИКИ являются живые организмы, находящиеся на всех уровнях эволюционного развития: - неклеточные формы (в и р у с ы, плазмиды) - м и к р о о р г а н и з м ы - р а с т е н и я - ж и в о т н ы е - ч е л о в е к
или x = или Что такое наследственность? • Основой наследственности является передача признаков от родителей к потомкам.
Что такое признак? • Признаком является особенность или качество живого организма. • Каждый из нас имеет различные сочетания признаков (черт), которые делают нас уникальными. • Признаки передаются из поколения в поколение.
Какие типы признаков существуют? • Физические признаки – это проявление характеристик внешнего вида (цвет волос, глаз, рост и другие). • Поведенческие признаки – это проявление характеристик поведения (пастушья овчарка имеет инстинкт охранять овец).
Предрасположенность к заболеваниям. • Повышенный риск получения определенного типа заболевания также является признаком, который может передаваться от родителей к детям. К таким заболеваниям относятся: серповидно-клеточная анемия, муковисцидоз, болезнь сердца, рака и некоторых видов психических заболеваний.
Проявление признаков у индивидуума контролируют гены в конкретных условиях окружающей среды: - признак - Окружающа среда - гены
Что определяет признаки? • Механизм проявления признаков зависит не только от генетического влияния, но и «экологического» . Иногда факторы окружающей среды могут изменить признак! Физический признак. Давайте рассмотрим несколько Предрасположенность к Генетика: Наши гены заболеваниям. примеров. определяют натуральный цвет волос. Окружающая среда : Воздействие солнца или краски для волос может легко изменить цвет. Генетика: Человек может родиться с повышенным риском болезни сердца. Окружающая среда: Здоровая пища и физические упражнения могут снизить этот риск.
- ЭТАПЫ РАЗВИТИЯ ГЕНЕТИКИ Доменделевский период V век до н. э. Гиппократ – умозрительная гипотеза «прямого наследования» (передаются признаки) IV век до н. э. Аристотель – умозрительная гипотеза «непрямого наследования» (передаются наследственные задатки) 1838 -1839 г. г. возникновение клеточной теории – Т. Шванн, М. Шлейден Т. Э. Найт (1759 -1838) – гибридизация гороха. Установил единообразие гибридов первого поколения и расщепление во втором. О. Сажрэ (1763 -1851) – комбинирование родительских признаков при гибридизации. 1 ЭТАП – от открытия (1865) до переоткрытия законов Менделя (1900) Г. -И. Мендель впервые сформировал и применил принципы гибридологического анализа для проверки конкретной гипотезы – гипотезы о передаче дискретных наследственных факторов. С 1870 по 1887 годы сформировалась клеточная теория. Были открыты хромосомы, описаны митоз, мейоз, оплодотворение, установлено постоянство хромосомных наборов. 2 ЭТАП – КЛАССИЧЕСКАЯ ГЕНЕТИКА (1900 -1953). В 1900 году вновь были открыты независимо друг от друга закономерности наследования, установленные Г. -И. Менделем. ГУГО ДЕ ФРИЗ (ГОЛЛАНДИЯ) КАРЛ КОРРЕНС (ГЕРМАНИЯ) ЭРИХ ЧЕРМАК (АВСТРИЯ)
ЭТАПЫ РАЗВИТИЯ ГЕНЕТИКИ 1904: Gregory Bateson открыл связь между генами. Ввел термин “генетика”. 1905: Nettie Stevens и Edmund Wilson Независимо открыли половые хромосомы-XX определяют женский организм; XY – мужской организм. 1910: Thomas Hunt Morgan доказывает, что гены находятся на хромосомах (показал на Drosophila). 1950: Erwin Chargaff открыл, что соотношение 1: 1 аденина к тимину и гуанину к цитозину в ДНК образцах различных организмов. 1951: Rosalind Franklin сфотографировала ДНК. 1953: James Watson and Francis Crick открыли структуру ДНК молекулы. 1966: Marshall Nirenberg расшифровали генетический код. 2001: Исследование генома человека.
Исследование наследственности начинается с работ Г. Менделя и его изучение садового гороха (Leguminosae family, Pisum sativum). Мендель был австрийским монахом, который жил в середине 1800’s.
Мендель отметил, что размер гороха изменяется. Он скрещивал это растение и нашел удивительные результаты. Почему горох? ? ? ! Ø Размножаются половым путем. Ø Имеют женские и мужские половые клетки - гаметы. Ø Их признаки легко выделить и контролировать. Mендель исследовал 7 различных контрастных пар признаков: рост один из них!
Таблица: Пары контрастных признаков отобранных Менделем. № Признаки Контрастные пары (Аллельные пары) (Доминантные) (Рецессивные) 1. Форма семян Круглые (R) Морщинистые (r) 2. Цвет семян Желтые (Y) Зеленые (y) 3. Цвет кожуры семян Цветной (C) Белый (c) 4. Форма стручка Раздутый Суженный (i) Inflated (I) 5. Цвет стручка Зеленый (G) Желтый (g) 6. Положение цветка Осевое Терминальное (a) Axial (A) 7. Рост или длина ствола растения Высокий (T) Карликовый (t)
X = X Скрещивание высоких растений 1 (P 1) P 1 x P 2 = = Скрещивание низких растений 2 (P 2) Гибриды – это Гибриды потомки родителей с контрастными признаками. F 1: с Latin - “filii” F 1:
Затем Мендель скрестил Mendel вторые поколения высокого гороха и получил расщепление 1: 3. F 1 x F 2 =
Правило Доминанты • Признак, который проявляется в потомстве первого поколения является доминантным признаком (Высокий рост – “H”, from “height”). • Признак, который не проявляется в потомстве F 1, а проявляется в F 2 является рецессивным признаком (Низкий рост – “h”). F 1:
Следовательно, работы Менделя привели к пониманию того, что признаки, такие как рост растений, наследуется от обоих родителей. Благодаря пионерским исследованиям Менделя, его последователи позже положения, которые стали основой генетики. Ø Носителями информации являются хромосомы. Ø Хромосомы состоят из частей, которые называются генами. Ø Гены состоят из ДНК.
Уровни генетических исследований 1. Гены экспрессируются на молекулярном уровне. Транскрипция и трансляция приводят к продукции специфического белка. Это молекулярный процесс. 2. Белки функционируют на клеточном уровне. Функции белка внутри клетки будут воздействовать на структуру и работу этой клетки. 3. Признаки организма определены характеристиками его клеток. Например, признак красный цветка - наблюдение на уровне организма. 4. Случайные признаки внутри видов наблюдаются на популяционном уровне. Наряду с изучением, как возникает признак, мы также хотим понимать, почему признак становится распространенным у определённых видов. Во многих случаях, мы обнаруживаем, что признак преобладает в пределах населения, потому что это продвигает выживание или копирование членов населения. Это приводит к эволюции выгодных признаков.
ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота, содержащая генетические инструкции, используемые в развитие и функционирование всех живых организмов. Макромолекулы ДНК обеспечивают хранение, передачу из поколения в поколение и реализацию генетической программы развития и функционирования живых организмов. Основная роль ДНК в клетках— долговременное хранение информации о структуре РНК и белков. • Молекула ДНК находится в ядре клетки и управляет всеми функциямивнутри клетки. • Хранит всю генетическую информацию для всего живого организма. • Молекула ДНК двухцепочечная - состоит из четырех нуклеотидных оснований: A, T, C, G. • Геном человека состоит из 3 миллиардов пар нуклеотидных оснований.
ДНК Молекула состоит из: 1. Сахара дезоксирибозы 2. Азотистых оснований a. Гуанин (пурин) б. Цитозин (пиримидин) в. Тимин (пиримидин) г. Аденин (пурин) 3. Остатка фосфорной кислоты Ширина двойной спирали составляет от 22 до 24 Å, или 2, 2 — 2, 4 нм, длина каждого нуклеотида 3, 3 Å (0, 33 нм). В двойной спирали различают малую (12 Å) и большую (22 Å)
Цепь ДНК А 5’ 3’ 5’ Ц 3’ – 3’ 5’-фосфодиэфирная связь Динуклеотид
Нуклеотиды соединены между собой ковалентно в длинные полинуклеотидные цепи. Цепи попарно объединяются при помощи водородных связей во вторичную структуру, получившую название двойной спирали. Внутри одной цепи ДНК соседние нуклеотиды соединены фосфодиэфирными связями, которые формируются в результате взаимодействия между 3'гидроксильной (3'—ОН) группой молекулы дезоксирибозы одного нукдеотида и 5'-фосфатной группой (5' —РО 3) другого. Асимметричные концы цепи ДНК называются 3' (три прим) и 5' (пять прим). В природе эта спираль, чаще всего, правозакрученная. Направления от 3'-конца к 5'-концу в
Принцип строения ДНК Пары оснований Водородные связи
Правила Чаргаффа 1. 2. 3. 4. Количество А =Т Количество Г=Ц А+Г=Т=Ц кол-во пуринов=кол-ву пиримидинов Соотношение А+Ц: Г+Т разное у разных ДНК
– Ген – структурная и функциональная единица наследственности живых организмов. Гены (аллели генов) определяют наследственные признаки организмов, передающиеся от родителей потомству при размножении. – Признак – характеристика организма, которая передается из поколения в поколение через ДНК. Цвет волос – пример признака Ген Алле ли— различные формы одного и того же гена, расположенные в одинаковых участках (локусах) гомологичных хромосом и определяющие альтернативные варианты
Ген: упорядоченная последовательность ДНК, расположенная в определенном положении на определенной хромосомы, которая кодирует определенный функциональный продукт (например, белки или РНК). Ген = функциональная и физическая единица наследственности, которая передается от родителей к потомкам. Хромосома = Структура, состоящая из ДНК и белка. Локус = Положение гена на хромосоме. Мутации = Изменение в ДНК последовательности. Характеристики = категория признака (цвет глаз, рост). Признак = физические, социальные и эмоциональные качества организма (доминантный и рецессивный).
На этом рисунке изображена карта генов, которые расположены на 4 хромосоме человека. Когда эти гены несут определенные редкие мутации, они могут вызвать заболеваний, указанных в эту цифру.
Фенотип и Генотип • Генотип — это совокупность всех генов организма, являющихся его наследственной основой. Фенотип — совокупность всех признаков и свойств организма, которые выявляются в процессе индивидуального развития в данных условиях и являются результатом взаимодействия генотипа с комплексом факторов внутренней и внешней среды. www. ansi. okstate. edu/breeds/swine/
• Методы генетических исследований.
ДНК фингерпринтинг Фингерпринтинг был изобретён в 1984 г. британским генетиком Алеком Джеффрейс и изучен на гене миоглобина. Применение Отцовство и материнство: некоторые конкретные образцы ДНК наследуется, можно доказать генетические отношения между людьми. В криминалистике: ДНК из образцов на месте преступления можно сравнить с ДНК подозреваемого. Личная идентификация: ДНК может быть использована, чтобы идентифицировать себя. Диагностика наследственных заболеваний (муковисцидоз, гемофилия, болезнь Хантингтона, семейной болезни Альцгеймера, серповидно-
Этапы проведения ДНК фингерпринтинга • Проводится в лаборатории. • 1: Изоляция ДНК. • 2 -3: Резка, калибровка и сортировка. Специальные ферментов - рестриктазы используются • для резки ДНК в определенных местах. 4 -5: Зондирование. Добавление радиоактивных или цветных зондов на нейлоновую поверхность приводит к образованию картины - ДНК-отпечатков. Каждый зонд специально прикреплен только к одному или двум положениям на нейлоновых листах. 6: ДНК отпечатки. Окончательные ДНК отпечатки построены по с помощью нескольких зондов (5 -10 и более) одновременно.
Клонирование Британский ученый Йен Вилмут возвестил всему млекопитающих миру о рождении первого клонированного млекопитающего – овечки Долли в 1997 году, – образование идентичных потомков которую он создал из клеток молочной железы. В 1998 году Долли родила здорового ягненка именем Бонни и еще 5 ягнят. С осени 2001 года у Долли был обнаружен артрит. 14 февраля 2003 года на седьмом году её жизни Долли пришлось усыпить. Причиной послужили прогрессирующее заболевание легких, вызванное ретровирусом JSRV], и тяжёлый артрит. (клонов) путем бесполого размножения. Результатом клонирования является популяция клеток или организмов с одинаковым набором генов.
клонирование Idaho Gem Tetra – rhesus monkey I’m called Copy Cat. What’s Your Name?
Клонирование постоянно происходит в естественных условиях, когда рождаются однояйцовые, или идентичные близнецы.
Клонирование эмбриональных стволовых клеток: “терапевтическое клонирование”
Изменение признаков животных и Например, ученые ввели растений ген, кодирующий биолюминесцентный зеленый флуоресцентный белок (GFP), медузы мышам. При воздействии синего или ультрафиолетового излучения, белок испускает зеленый цвет. Ученым удалось клонировать ген GFP из образца клеток медуз, а затем ввести этот ген в лабораторных мышей. В результате их кожа, глаза и органы обладают зеленым свечением под воздействием УФ-света.
Генная инженерия — совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток), осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы.
Как делают ГМО? Получение (ГМО) связано со «встраиванием» в ДНК растений или животных чужого гена от других организмов с целью изменения свойств и параметров (производят транспортировку гена трансгенизацию) Есть два способа введения гена: • Агробактериальный. • Биобаллистический
Этапы получения ГМО ДНК содержащ ая выбранны й ген извлекает ся из клетки Вырезанны й ген встраивает ся в ДНК Выбранн ый ген вырезает ся из ДНК Гибридная клетка дает потомство, наследующее новые свойства Мутации ДНК
ПЕРСПЕКТИВНЫЕ ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ТРАНСГЕННЫХ организмов • Получение модифицированного молока. • Создание трансгенных животных, источников органов для пересадки человеку. • Клонирование трансгенных животных
Химерные организмы. • Химерные животные – это генетические мозаики, образующиеся в результате объединения бластомеров от эмбрионов с разными генотипами. • Принцип получения химер сводится главным образом к выделению двух и большего числа ранних зародышей и их слиянию. В том случае, когда в генотипе зародышей, использованных для создания химеры, есть отличия по ряду характеристик, удается проследить судьбу клеток обоих типов. • Для получения "химер" культуральные клетки двух разных животных обрабатывают специальными вирусными препаратами,
Три главных области генетики Классическая генетика Молекулярная генетика Эволюционная генетика Законы Менделя Геном Количественная генетика Мейоз+митоз Структура ДНК Популяционная генетика Определение пола Химия ДНК Сцепление с полом Транскрипция Хромосомальное картирование Трансляция Цитогенетика Контроль за экспрессией генов ДНК клонирование Эволюция
Медицинские исследования генетических болезней. genealogic examination Classical genetics family chromosomes patient DNA molecular biological examination Molecular cytogenetic examination
Ø Ø Ø Методы классической Цель Мето генетики. д Анализировать перенос признаков Гибридологический анали из поколения в поколение; (не для людей) Определить взаимодействия “доминантности-рецессивности” между альтернативными признаками; Генеалогический анали Определить сколько генов (для людей) контролируют проявление признака; Определить, где на хромосоме локализованы гены. Найти место на хромосоме, где расположен ген; Определить качественные или Цитогенетический анали (для всех организмов) количественные отклонения имеют место на хромосоме.
Методы молекулярной генетики. Основной целью является определение первопричины генетически обусловленных болезней на молекулярном уровне – определить молекулы, ответственные за признак. Phenotype (trait, feature) mutation DNA RNA Изменения в ДНК экспрессии последовательн генов, синтез ост, анормальной хромосомные РНК молекуле абберации protein Изменения функции и Изменения структуры ферментативн органов, ой активности, врожденные дефекты метаболически структуры е ошибки, клеток и ткани дефекты в
Методы молекулярной Цель Мето генетики. Получить общий зонд для ДНК д ДНК экстракция данного организма. Разрезать целую ДНК на Реакции рестрикции фрагменты для дальнейших Полимеразная манипуляций. Множить специфические цепная реакция (ПЦР) фрагменты ДНК Блоттинг Определить является ли фрагмент ДНК Изолировать специфический элементом целой ДНК. фрагмент мишени (человека) Молекулярное клониров ДНК, в который встраивают фрагмент ДНК микроорганизмов Определить последовательность ДНК секвестирование (бактерий, дрожжей). нуклеотидов в ДНК. Отделить фрагмент ДНК или Электрофорез белков, который отличается в любой комбинации размера и
Что такое ферменты? – Белки, которые ускоряют химические реакции в организме – Субстрат = молекула, с которой фермент взаимодействует – Функция фермента высоко зависит от окружающих характеристик, таких как температура и p. H.
Ферменты рестрикции – мощный инструмент молекулярной генетики Нуклеазы: • Экзонуклеазы: удаление нуклеотидов от конца ДНК или РНК • Эндонуклеазы: разрезают внутренние фосфодиэфирные связи Эндонуклеазы: • Открыты в конце 1960 г. • Найдены и очищены из бактерий • Три типа: • Тип I и III: не узнают специфическую последовательность ДНК или РНК • Type II: разрезают специфическую последовательность
Фермент типа II: II • Свыше 2500 различных ферментов были изолированы • Более чем 500 ферментов комерчески доступны • Разрезают часто палиндромные гексонуклеотидные последовательности • Eco. RI : GAATTC • CTTAAG • Большинство ферментов разрезают внутри последовательности
A sticky end: 1. Modern methods of genetic research. Restriction enzyme cuts here Each strand has a ”sticky” end Strands separate A blunt end: Restriction enzyme cuts here Strands separate Each strand has a ”blunt” end
Что такое ПЦР (Полимеразная Цепная Реакция)? Амплификация (мультиплификация) значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов нуклеиновой кислоты (ДНК) в биологическом материале (пробе) Изобрел в 1983 году американский ученый Кэри Мюллис. Компоненты “Реакции” 1) ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать. 2) Два праймера, комплементарные противоположным концам разных цепей требуемого фрагмента ДНК. 3) Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (d. ATP, d. GTP, d. CTP, d. TTP). 4) Термостабильная ДНК-полимераза — фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК (ферменты, выделенные из термофилов — Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и другие. ). 5) Ионы Mg 2+, необходимые для работы полимеразы. 6) Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции — р. Н, ионную силу раствора. Содержит соли, бычий сывороточный альбумин. Чтобы избежать испарения реакционной смеси, в пробирку добавляют высококипящее масло, например, вазелиновое.
ПЦР Метод основан на многократном избирательном копировании определённого участка ДНК при помощи ферментов в искусственных условиях. При этом происходит копирование только того участка, который удовлетворяет заданным условиям, и только в том случае, если он присутствует в исследуемом образце. С помощью смеси различных полимераз, с использованием добавок и при определённых условиях длина ПЦР-фрагмента может достигать 20— 40 тысяч пар нуклеотидов.
Праймеры DNA-Polymerase + Nucleotides 3 основных этапа ПЦР: Денатурация Отжиг Элонгация Денатурация, отжиг x 30 Элонгация
Денатурация Двухцепочечную ДНКматрицу нагревают до 94— 96 °C (или до 98 °C, если используется особенно термостабильная полимераза) на 0, 5— 2 мин, чтобы цепи ДНК разошлись. • Медленное охлаждение отжигов двух нитей ренатурация Горячий Холодны
Отжиг Когда цепи разошлись, температуру понижают, чтобы праймеры могли связаться с одноцепочечной матрицей. Время стадии отжига — 30 cек, одновременно, за это время полимераза уже успевает синтезировать несколько сотен нуклеотидов, 45 - 60 °.
Элонгация ДНК-полимераза реплицирует матричную цепь, используя праймер в качестве затравки. Полимераза начинает синтез второй цепи от 3'-конца праймера, который связался с матрицей, и движется вдоль матрицы, синтезируя новую цепь в направлении от 5' к 3' концу. Часто используемые полимеразы Taq и Pfu наиболее активны при 72 °C. Обычно время элонгации принимают равным одной минуте на каждую тысячу пар оснований.
ПЦР
ДНК-РНК амплификат ор Визуализация и идентификация фрагментов ДНК
Применение ПЦР Молекулярная идентификация Секвестирование Генная инжинерия • Биоинформатика • Сайт-направленный мутагенез • Молекулярная Археология Геномное клонирование • • Молекулярная Эпидемиология Исследования • Геном человека • Молекулярная Экология экспрессии генов • ДНК фингерпринтинг • Классификация организмов • Генотипирование • Пренатальная диагностика • Анализ мутаций • Открытие лекарств • Генетическое соответствие • Определение патогенеза
ПЦР кровь, хорионическая жидкость, амниотическая жидкость, сперма, корни волос, слюна 68, 719, 476, 736 копий Гелевый анализ Рестрикция Секвестировани е
Технические проблемы • Контаминация • Чувствительность к уровню двухвалентных катионов • Качество ДНК матрицы • Ограниченный размер продукта амплификации.
Гелевый электрофорез • Метод, который разделяет макромолекулы на основе: – Размера – Электрического заряда – Других физических особенностей • Силы электрического поля, прикладываемого к образцам, заставляют фрагменты ДНК мигрировать через гель. • Сахарофосфатный остов молекул ДНК заряжен отрицательно и поэтому цепи ДНК двигаются от катода заряженного отрицательно, к положительному аноду. Более длинные молекулы мигрируют медленнее, так как задерживаются в геле, более короткие молекулы двигаются быстрее. • Электрическое поле создается через гель
Что требуется для гелевого электрофореза? • Электрофорез проводится в камере, заполненной буферным раствором. Чаще всего используются буферы, содержащие ЭДТА, трис и борную кислоту: ТАЕ и ТВЕ. Буфер необходим для повышения ионной силы раствора, в котором будет происходить разделение молекул ДНК под действием приложенного электрического поля. • Для электрофоретического анализа ДНК обычно используют агарозные (для относительно длинных молекул ДНК) и полиакриламидные (для высокого разрешения коротких молекул ДНК, например, в случае секвенирования) гели. • Определение размеров производят путем сравнения коммерчески доступных фрагментов ДНК (DNA ladder, «линейка» ), содержащий линейные фрагменты ДНК известной длины. Краситель
Молекулярно-генетические методы • Секвенирование – определение нуклеотидной последовательности. • 1. Химическое (метод Максама. Гильберта) – химическое расщепление ДНК по одному основанию. • 2. Дидезоксисеквенирование (метод. Сенджера)-искусственно синтезируют нужные цепи ДНКмеченные олигонуклеотидные праймеры, гибридизируют с однонитевой исследуемой ДНК с последующим электрофорезом в геле.
Молекулярно-генетические методы • Блот-гибридизация по Саузерну • 1 этап рестрикция ДНК на фрагменты. Используются специальные ферменты-рестриктазы, разрывающие двухцепочечную ДНК в пределах строго определенных для каждого фермента последовательностей (4 -6 пар оснований). • 2 этап-разделение фрагментов ДНК на поверхности агарозного или
Блот-гибридизация по Саузерну • 3 этап - блоттинг или перенос ДНК на нитроцеллюлозный или нейлоновый фильтр в буферном растворе. • 4 этап - гибридизация со специальными нуклеотидными последовательностями, меченными радиоизотопной, иммунологической или флуоресцентной меткой. Инкубация, отмывка, визуализация, анализ.
Геноскопия. ДНК-отпечатки матери, ребенка и двух предполагаемых отцов
Семейный анализ фрагментов ДНК с помощью блотгибридизации по Саузерну М – мать Р – ребенок О – отец
Методы эволюционной генетики. Основная цель заключается в определении относительного влияния генотипа и среды в фенотипической изменчивости в популяции. Г О Признак (P)
Близнецовый метод • Основывается на существовании двух типов близнецов – могозиготных и дизиготных. • Монозиготные близнецы развиваются из одной оплодотворенной яйцеклетки. Процесс развития монозиготных близнецов происходит после оплодотворения и ограничивается самыми ранними стадиями эмбриогенеза, так как эмбрион не способен к разделению после своего формирования. Из генотипы имеют 100% сходство. • Дизиготные близнецы развиваются из двух разных яйцеклеток, оплодотворенных разными сперматозоидами. Общих генов 50%.
Близнецовый метод Монозиготные близнецы
Близнецовый метод Дизиготные близнецы
Близнецовый метод • Данный метод позволяет выяснить наследственную предрасположенность человека к некоторым заболеваниям (сахарный диабет, эпилепсия, шизофрения и другие. ) • Любой признак – это результат взаимодействия генотипа и среды, в которой реализуется генетическая программа E+G=1, где E – вклад среды, G – вклад наследственности. Сравниваем реализацию генетической программы с учетом действия средовых факторов среди моно- и дизиготных близнецов.
Близнецовый метод • • Вычисление доли наследственности и доли среды в развитие определенного признака. Коэффициент наследуемости вычисляется по формуе Хольцингера • Н= (С мз. -С дз. )/(100 - С дз. ) • P= 1 -H, • где H – коэффициент наследуемости. • Cмз. – коэффициент конкордантности для монозиготных близнецов. • Cдз. – коэффициент конкордантности для дизиготных близнецов. • P – соотношение влияния окружающей среды к формированию исследуемого признака. • 1 -0, 7 - признак (болезнь) определяется генетическими факторами. • 0, 3 -0, 7 - признак (болезнь) с генетической предрасположенностью, но может изменяться под влиянием окружающей среды. • 0 -0, 3 - признак (болезнь), возникающая под влиянием окружающей среды. Конкордантность (сходство) оценивается в % и изучается для каждого из близнецов. Дискордантность (D) по признаку, как правило, рассчитывается для дизиготных близнецов, как доля дискордантных (т. е. признак выявлен только у одного из двух партнеров) по изучаемому признаку пар среди
Задача. Конкондартность монозиготных близнецов к шизофрении составляет 67% и дизиготных близнецов - 12. 1%. Какая доля влияния наследственности и среды в развитии шизофрении? Решение. 1. Дано CMZ = 67%, CDZ= 12. 1%. 2. H = (CMZ - CDZ) / (100 - CDZ), P = 1 – H 3. Рассчитываем. H = (67 - 12. 1) / (100 - 12. 1) = 54. 9 / 87. 9 = 0. 645 4. P = 1 - H = 1 - 0. 645 = 0. 355 Ответ. Доля наследственности в развитии шизофрении равно 0. 645, а доля окружающей среды в развитии этого патологического признака 0, 355.
Задача. Изучали 46 пар монозиготных и 120 парах дизиготных близнецов. Во всех этих парах, по крайней мере один из близнецов страдал от бронхиальной астмы. У 23 пар монозиготных близнецов и 6 пар дизиготных близнецов второй близнец тоже страдал от бронхиальной астмы. Определить коэффициент наследуемости астмы. Решение. 1. Мы рассчитываем коэффициент конкордантности к астме для монозиготных близнецов. CMD = 23/46 = 0, 5 = 50%. 2. Затем вычисляется коэффициент конкордантности к астме для дизиготных близнецов. CDZ = 6/120 = 0, 05 = 5%. 3. Запишем формулу, чтобы оценить степень участия наследственности в формировании бронхиальной астмы H = (CMD - CDZ) / (100 - CDZ) 4. Мы рассчитываем коэффициент наследуемости астмы: H = (50 - 5) / (100 - 5) = 45/95 = 0, 47 Ответ. Коэффициент наследуемости астмы составляет 0, 47. Это означает, что развитие этого заболевания в значительной степени зависит от генотипа человека, но может изменяться под влиянием окружающей среды.
Популяционный метод – Основан на изучении генетических закономерностей в популяциях человека. – Позволяет оценить вероятность рождения лиц с определенным фенотипом в данной группе населения (семье). – Позволяет рассчитать частоту носительства в гетерозиготном Популяция - совокупность особей одного вида, обладающих общим генофондом и состоянии рецессивных аллелей. занимающих определенную территорию
Дерматоглифический анализ • Изучение гребешков кожи человека (кожи подушечек пальцев кисти и стопы), где сильно выраженный сосочковый слой. • Метод применения: • Для установления зиготности близнецов. • Экспресс – метод диагностики врожденных некоторых наследственных заболеваний. • При патологии отмечается сочетание
Генетический анализ популяции: – Изучение распространенности того или иного признака (болезни). – Определение генетической структуры популяции по этому признаку. – Зависит от количества индивидуумов в популяции: – 1. Изоляты. – 2. Демы. – 3. Большие популяции.
Изоляты: – Численность не более 1500 человек. – Представители из других групп людей не более 1%. – Частота внутригрупповых браков свыше 90%. – Естественный прирост населения за 25 лет менее 25%.
Демы: – Численность от1500 до 4000 человек. – Представители других групп людей – 1 -2%. – Частота внутригрупповых браков 8090%. – Прирост населения за 25 лет не более 25%.
Большие популяции: – Характеризуются большим количеством членов и численно продолжают возрастать (население города). – В них снижается действие естественного отбора. – Преобладают панмиктические браки (свободный подбор супружеских пар).
Математическая зависимость между частотами генов и генотипов. Установили: математик Г. Харди в Англии и врач В. Вайнберг в Германии (1908 г. ). Закон Харди – Вайнберга – в большой панмиктической популяции из поколения в поколение сохраняется строго определенное соотношение частот генотипических классов особей. Установившееся равновесие генотипов (АА, Аа, аа) описывается равенством: p 2(AA) + 2 pg(Aa) + g 2(aa) = 1 p(A) + g(a) = 1
Частота гетерозигот (Аа) по рецессивным мутантным генам всегда в несколько раз выше частоты больных (аа). Например: – Частота гетерозигот по гену ФКУ – 1 : 70. – Частота больных ФКУ - 1 : 20000.
Изменение генетической структуры и генофонда популяции – элементарное эволюционное явление.
Мутационный процесс характеризуется: – Это постоянно действующий фактор. – Ненаправленный фактор, ведет к появлению самых разных мутаций – элементарного эволюционного материала. – Постоянно поддерживает высокую степень гетерогенности популяций. – Приводит к накоплению отрицательных мутаций – «генетический груз» (6% от общего числа новорожденных). Каждый из нас – носитель 8 вредных мутаций, скрытых у Аа.
Мутации изменяют генетическую структуру популяции с очень малой скоростью. Например, чтобы снизить частоту гена (А) от 0, 5 до 0, 49 потребуется 2000 поколений.
Дрейф генов – случайные ненаправленные изменения в частоте генов, происходящие в каждом поколении. – Наблюдается при резких изменениях численности популяций (популяционные волны). – При этом, ранее присутствующие в малых концентрациях мутантные гены могут исчезнуть из популяции, а концентрация других мутаций может случайно резко повыситься. – Дрейф генов особенно заметен в изолятах.
Генный полиморфизм – наличие двух и более аллелей одного гена. Полиморфные системы человека Название Основные аллели АВО(Н) А 1, А 2, В, Н Резус Комплекс генов: С, с, Д, д, Е, е Лейкоцитарные A-25, B-50, C-8, D-35, DR-16 Антигены - HLA
Балансированный (гетерозиготный) полиморфизм – способствует сохранению в популяции рецессивных аллелей за счет селективного преимущества гетерозиготных особей. Гемоглобинопатии человека и их распространение в регионах, не благополучных по тропической малярии Аллель Гемоглобинопатия Распространение Hb. S Анемия S Тропическая Африка, Средиземноморье (у 40% населения) Hb. C Анемия C Западная Африка Hb. D Анемия D Северо-Западная Индия, негритянское население США
Адаптивный (экологический) генный полиморфизм – отбор особей с разными генотипами, генетически оказывающихся лучше адаптированными к меняющимся условиям среды Аллели генов человека, имеющих адаптивное значение Аллели Адаптивное значение Аллель А (АВО) Относительная устойчивость к язвенной болезни желудка и 12 перстной кишки Аллель В (АВО) Относительная устойчивость к чуме Аллель DRw 6 (HLA) Устойчивость к инсулин-зависимому сахарному диабету
Модели организмов для генетических исследований должны иметь основные критерии: – Быстро расти – Короткий жизненный цикл – Производить много потомков – Относительно недорогие – Легко манипулировать/ мутировать • “KNOCK OUT” или “TURN OFF” гены, затем проводить исследования последствий
Рассмотрим некоторые лабораторные модели организмов • E. coli (бактерия) • Пекарские дрожжи • Нематоды (круглые черви) Caenorhabditis elegans (C. elegans) • Плодовая мушка Drosophila melanogaster • Лабораторные мыши
Почему мы не можем использовать людей? • Слишком большой организм – 100 триллионов клеток (без эритроцитов) – Большая масса • ~40, 000 генов на 46 хромосомах – 6 футов ДНК • Длительная продолжительность жизни (в среднем 40 -75 лет) • Новое поколение каждые 25 лет • Не этично!
E. coli бактерия (прокариоты) • Обычно встречаются в пищеварительной системе • 4288 генов на 1 хромосоме • Быстро растут – E. coli клетки могут размножаться каждые 20 минут. • Простые потребности • ОЧЕНЬ легко манипулировать их ДНК • Создание рекомбинантной ДНК с помощью плазмид • Изучают: вирусные болезни и
Пекарские дрожжи (одноклеточные эукариоты) • Очень маленькие, легко найти • Размножаются легко, каждые 90 минут • 6000 генов на 6 хромосомах • 31% являются эквивалентными генам людей • Весь геном был расшифрован в 1996. • Изучают репродукцию человека и рак
C. elegans (круглый червь) (многоклеточный организм) • Очень маленькие – 1 мм длиной! • Гермафродиты • Продолжительность жизни: 2 -3 недели • Новое поколение каждые 3 дня • 19, 099 генов – 40% являются эквивалентными генам человека • Изучают: – Апоптоз, развитие животных
Фруктовая муха Drosophila melanogaster (многоклеточные) • Маленькие – 4 мм длиной! • Продолжительность жизни: 2 -3 месяца • Новое поколение каждые 10 дней • 13, 600 генов – 50% являются эквивалентными генам человека • Расшифрован весь геном в 2000. • Изучают мутации, развитие животных, нейроны, поведение, онкологические Заболевания.
Лабораторные мыши (многоклеточные, эукариоты) • Ближайший родственник человека среди “моделей” – Позвоночные, млекопитающие • Продолжительность жизни 2 года • Новое поколение каждые 9 недель • ~40, 000 генов (как и у человека) – ~99% являются эквивалентными генам человека
Генетические болезни человека также найдены в организмах-моделях • Мухи, черви, дрожжи имеют гены такие же как у людей, ответственные за развитие болезней, таких как: – Болезни сердца – Карликовость – Панкреатический рак (только мухи) – Мышечная дистрофия Дюшенна (кроме дрожжей) – Рак кожи – Болезнь Вильсона – Лейкемия (кроме дрожжей) – Цистический фиброз (кроме дрожжей)
Скачать презентацию Медицинская биология Генетика Практическое занятие 1 Терминология
Topic 1.ppt