Матричные биосинтезы Репликация репарация Транскрипция Трансляция Репликация

Матричные биосинтезы Репликация (репарация) Транскрипция Трансляция

Репликация ДНК Основные принципы репликации ДНК Компоненты реплисомы Репликация ДНК E. coli Репликация ДНК у эукариот Репарация ДНК 2

Три механизма репликации ДНК а) полуконсервативная; б) консервативная; в) дисперсивная 3

Репликация ДНК – полуконсервативный прерывистый механизм Каждая цепь ДНК служит матрицей для синтеза комплементарной дочерней цепи. Лидирующая цепь ДНК – синтез дочерней ДНК – идет непрерывно в направлении 5´→ 3´, совпадающим с движением репликативной Вилки. Отстающая цепь – синтез прерывистый, в виде фрагментов Оказаки. 4

Для биосинтеза ДНК необходимо: 1) неспаренная цепь – как матрица и цепь затравка; 2) полный набор дезоксирибонуклеотидфосфатов, которые служат субстратом и источником энергии для дочерней ДНК молекулы; 3) ферменты и белки - репликасома

Репликация осуществляется сложным комплексом ферментов и белков – реплисомой РЕПЛИСОМА – сложный и эффективно работающий репликативный комплекс, состоящий примерно из 40 белков и включающий: • ДНК-полимеразу; • хеликазу (rep-белок); • топоизомеразу; • ssb-белок; • праймазу; • ДНК-лигазу; • множество дополнительных белков. 6

ДНК-полимеразы прокариот У прокариот есть три ДНК-полимеразы – Pol I (1), Pol II (2) и Pol III (3) В репликации ДНК участвуют Pol I и Pol III (1) обладает полимеразной и (3´→ 5´ , 5´→ 3´) экзонуклеазной активностью; участвует в удалении праймера, застройки образовавшейся бреши, коррекции ошибок (2) осуществляет репаративный синтез ДНК (3) обладает полимеразной и 3´→ 5´ – экзонуклеазной активностью; синтезирует лидирующую и отстающую цепь ДНК, обладает корректорской функцией (основной фермент репликации ДНК) ■ 7

ДНК-полимераза III E. coli Кор-фермент (αθε) β-белок выполняет функцию «скользящего зажима» . τ- белок – сборка и димеризация холофермента ДНК-полимеразы γ-комплекс (γ, δ, δ´, χ, ψ) – ДНК-зависимая АТРаза, связывание затравки с матрицей, активация ДНК-полимеразы. 8

Белки, входящие в состав репликативного комплекса • Dna A – узнавание области начала репликации, привлечение к месту сборки остальных белковых компонентов • Dna B – ДНК-хеликаза – разделение цепей ДНК в репликативной вилке • Dna C – обеспечение взаимодействия хеликазы и праймазы с ДНК • Гистоноподобный белок – стимулирует инициацию • ДНК-связывющий белок (ssb) – стабилизирует расплетенные одноцепоченые ДНК, связываясь с ними, и повышает активность хеликазы • Dna G – праймаза – синтез РНК-затравок • ДНК-лигаза – соединяет концы фрагментов ДНК • Топоизомераза I – релаксирование отрицательной суперспирализации • Топоизомераза II (ДНК-гираза)– индуцирование образования отрицательных сверхвитков. • Dam метилаза – метлирует (5 ´)УАТЦ последовательность в ori. C. 9

Архитектура репликационного комплекса ДНК-полимеразы III E. coli 10

Действие ДНК-полимеразы 11

Стадия инициации

Синтез праймера на лидирующей цепи ДНК РНК-полимеразой (праймазой) 13

ДНК-полимераза и праймаза – переход на отстающую цепь ДНК 14

Преодоление антипараллельности цепей при репликации за счет возникновения петли 15

Образование фрагмента Оказаки на отстающей цепи ДНК 16

Элонгация репликации 17

Элонгация репликации (процессинг фрагментов Оказаки) 18

Образование фрагментов Оказаки за счет образования петли на запаздывающей цепи

Функции ДНК-полимеразы I 21

Белки, входящие в состав репликативного комплекса эукариот ■ ДНК-зависимые ДНК-полимеразы – α, β, δ, ε, γ, ζ ■ ДНК-полимеразы α, β, δ, ε – непосредственно участвуют в репликации ДНК ■ ДНК-полимераза α представлена в клетке в виде прочного комплекса с ДНК-праймазой – ферментов, осуществляющих синтез РНК-затравок; не обладает корректорской 3´→ 5´ – экзонуклеазной активностью ■ ДНК-полимераза β – репарация ядерной ДНК, процессинг фрагментов Оказаки ■ ДНК-полимераза δ – синтез лидирующей цепи геномной ДНК ■ ДНК-полимераза ε – синтез отстающей цепи геномной ДНК ■ ДНК-полимераза γ – репликация и репарация митохондриальной ДНК ■ ДНК-полимераза ζ – синтез ДНК на поврежденной матрице при SOSответе 22

Репликация теломерных участков хромосом 23

Скорость репликациии: 1000– 2000 нуклеотидов в секунду у прокариот; 100– 200 нуклеотидов в секунду у эукариот. Точность репликации: один ошибочно встроенный нуклеотид на 109 – 1011 нуклеотидов. 24

Основные типы повреждений ДНК ■ Повреждение одиночных оснований (дезаминирование цитозина в урацил, аденина в гипоксантин; алкилирование оснований; включение аналогов оснований; инсерции и делеции нуклеотидов. ■ Повреждение пары оснований, например, индуцированное УФ-излучением образование тиминовых димеров. ■ Разрывы цепей при действии ионизирующей радиации. ■ Образование перекрестных связей между основаниями, а также между ДНК и белками, например, гистонами. 25

Образование тиминовых димеров 26

Репарация тиминовых димеров у эукариот 27

Транскрипция (биосинтез РНК) Транскрипция – общие представления РНК-полимеразы Этапы транскрипции Регуляция транскрипции Процессинг первичных транскриптов РНК 28

■ Транскрипция – биосинтез РНК на матрице ДНК ■ Транскрипция – начальная стадия реализации генетической информации в клетке ■ Основой транскрипции является фундаментальный принцип комплементарности азотистых оснований полинуклеотидных цепей ДНК и РНК ■ В процессе транскрипции синтезируются м. РНК, т. РНК, р. РНК и другие виды РНК, выполняющие структурные, регуляторные и каталитические функции ■ Процесс транскрипции осуществляется ДНК-зависимыми РНК-полимеразами

■ Единица транскрипции – транскриптон ■ Транскриптоны бактерий называют оперонами ■ В транскриптоне присутствует последовательность, которая называется промотором (зона начала транскрипции) и терминатором (зона остановки транскрипции) ■ У прокариот один фермент синтезирует все виды РНК, у эукариот разные виды РНК синтезируются различными РНК-полимеразами

Транскрибируется только одна из комплементарных цепей ДНК, а именно матричная цепь. Другая цепь ДНК называется кодирующей цепью (смысловой), поскольку ее последовательность идентична последовательности РНК. Нематричная (кодирующая) цепь: TACGGATA Матричная цепь: ATGCCTAT РНК, которая синтезируется на основе этого участка: UACGGAUA

Бактериальная РНК-полимераза Состоит из 5 субъединиц: 2αββ΄δ Коровый фермент: 2αββ΄δ (α – каждая по 40 к. Да), (β – 155 к. Да), (β΄ – 160 к. Да) Холофермент: 2αββ΄δω (δ – 70 к. Да), (ω – ? ) 480 к. Да

Бактериальная РНК-полимераза

Эукариотические РНКполимеразы

Фрагмент структуры РНК-полимеразы II Cпираль ДНК (синяя), растущая цепь РНК (красная), ион металла в активном центре в виде фиолетовой сферы и «мостиковая» a-спираль (зеленая).

Структура промотора

Общая схема транскрипционного цикла

Инициация

Комплекс инициации транскрипции у эукариот В составе комплекса приведены общие факторы транскрипции (TFIIB, E, F, H и TBP), РНК-полимераза II, медиатор и специфический фактор транскрипции, связанный с энхансером.

ЭЛОНГАЦИЯ

ЭЛОНГАЦИОННЫЙ КОМПЛЕКС

ТЕРМИНАЦИЯ

Регуляция экспрессии генов путем индукции

Регуляция экспрессии генов путем репрессии

Регуляция экспрессии гена у эукариот

Сплайсинг – вырезание копий интронов из про-m. РНК и сшивание копий экзонов с образованием m. РНК.

Процессинг первичных транскриптов РНК Образование зрелой, функционально активной молекулы т. РНК. Модификация 3´-ОН конца и присоединение ССАтриплета. Удаление из антикодоновой ветви интронной последовательности с помощью эндонуклеазы и лигазы.

Трансляция (биосинтез белка) Трансляция – общие представления Генетический код Активация и транспорт аминокислот в рибосомы Белоксинтезирующая система Этапы трансляции Регуляция транскрипции Посттрансляционный процессинг 49

■ Трансляция – это процесс декодиролвания м. РНК, в результате которого информация с языка последовательности нуклеотидов в м. РНК переводится (транслируется) в последовательность аминокислотных остатков полипептидной цепи. ■ Правила, которым следует трансляция, называется генетическим кодом. ■ Трансляция осуществляется на рибосомах. ■ Декодирование м. РНК осуществляется в направлении 5´→ 3´, как и в процессе репликации и транскрипции.

■ Трансляция осуществляется в несколько стадий: 1) активация аминокислот; 2) аминоацилирование т. РНК; 3) собственно трансляция; 4) посттрансляционная модификация (процессинг) полипептидной цепи. ■ Для синтеза белка необходимы: 1) информация о структуре синтезируемого белка (м. РНК); 2) рибосомы; 3) т. РНК; 4) 20 аминокислот; 5) ферменты аминоацил-т. РНК-синтетазы; 6) белковые факторы трансляции; 7) АТР и GTP, ионы Mg 2+.

Свойства генетического кода ■ Код триплетен ■ Код не перекрывается ■ Код вырожден ■ Рамка считывания задает положение первого основания кодона м. РНК (гена) ■ Код универсален

Код ДНК. Свойства кода 1. Триплетность. Каждая аминокислота кодируется триплетом нуклеотидов – кодоном. 2. Однозначность. Кодовый триплет, кодон, соответствует только одной аминокислоте. 3. Вырожденность (избыточность). Одну аминокислоту могут кодировать несколько (до шести) кодонов.

Код ДНК. Свойства кода 4. Универсальность. Генетический код одинаков, одинаковые аминокислоты кодируются одними и теми же триплетами нуклеотидов у всех организмов Земли. 5. Неперекрываемость. Последовательность нуклеотидов имеет рамку считывания по 3 нуклеотида, один и тот же нуклеотид не может быть в составе двух триплетов. (Жил был кот тих был сер мил мне тот кот); 6. Наличие кодона- инициатора и кодоновтерминаторов. Из 64 кодовых триплетов 61 кодон — кодирующие, кодируют аминокислоты, а 3 — бессмысленные, не кодируют аминокислоты, терминирующие синтез полипептида при работе рибосомы (УАА, УГА, УАГ). Кроме того, есть кодон — инициатор (метиониновый), с которого начинается синтез любого полипептида.

Аминоацил-т. РНК-синтетаза Mg 2+ 1. АК + АТР → АК ~ АМР + Н 4 Р 2 О 7 Mg 2+ 2. АК~ АМР + т. РНК → АК~ т. РНК + АМР

Структура аминоацил -т. РНК

Активация и транспорт аминокислот в рибосомы Строение аминоацил-т. РНК-синтетаз: а – класс 1; б – класс 2

Активация и транспорт аминокислот в рибосомы

Белоксинтезирующая система 50 S и 30 S субчастицы рибосомы

РНК-связывающие участки рибосомы А – аминоацил-т. РНКсвязывающий участок; Р – пептидил-т. РНКсвязывающий участок; Е – участок выхода т. РНК

Общая схема биосинтеза белков в клетке

Общая схема трансляции

Инициация трансляции у прокариот

Этапы трансляции

70 S рибосома

Элонгация трансляции у прокариот

Регуляция транскрипции Регуляция железом трансляции м. РНК ферритина и стабильности м. РНК рецептора трансферрина

Посттранскрипционный процессинг

Роль шаперонов в фолдинге полипептидной цепи

Образование инициирующей аминоацил-т. РНК

Образование инициирующего комплекса

Функционирующая рибосома

Удлинение полипептидной цепи молекула РНК, отделившаяся от полипептидной цепи АК 1 АК 2 АК 3 АК 4 пептидил-т-РНК аминоацил-т. РНК АК 1 АК 2 АК 3 АК 4

Строение полирибосомы

Посттрансляционный процессинг Модификация N-конца полипептидной цепи Фолдинг (формирование пространственной структуры) Химическая модификация (гидроксилирование, гликозилирование и др. ) Присоединение простетических групп (у гетеропротеинов) Объединение протомеров при образовании олигомерных белков Присоединение сигнальных пептидов для выхода белка из клетки

Регуляция биосинтеза

Действие регуляторных белков

Действие антибиотиков