Матричные биосинтезы
Матричные биосинтезы n n При биосинтезе белков и нуклеиновых кислот матрицей служат нуклеиновые кислоты. Матрица в ходе матричного синтеза не расходуется и может использоваться многократно.
Существует три основных типа матричных биосинтезов. n n n Биосинтез ДНК (репликация ДНК) с использованием в качестве матрицы уже существующих молекул ДНК. Биосинтез РНК на матрице ДНК (транскрипция). Биосинтез белков с использованием в качестве матрицы и-РНК (трансляция).
Основной постулат молекулярной биологии Обратная транскрипция ДНК D РНК транскрипция g белок трансляция
Генетическая организация генома млекопитающих n n Гаплоидный геном каждой клетки представлен 3, 5*10 парами оснований и состоит из 23 пар хромосом. Это достаточно для кодирования 1, 5 мм пар генов. В организме около 100 000 белков. Это означает, что большая часть геномной ДНК не кодируется.
ДНК генома делят на: Уникальные (неповторяющиеся) последовательности ДНК. Они кодируют белки. n Повторяющиеся последовательности ДНК. Составляют 20 -30% генома. Высоко повторяющиеся последовательности транскрипционно неактивны. n
Строение ДНК Молекула ДНК среднего размера n имеет длину 4 см. n содержит 150 000 нуклеотидных пар. n Общая длина ДНК в 23 парах хромосом человека 1, 5 м. n Первичная структура ДНК характеризуется видовой специфичностью
Первичная структура ДНК: порядок чередования дезоксирибонуклеотидов в полинуклеотидной цепи. Мононуклеотиды связаны 3`-5` -фосфодиэфирными связями.
Вторичная структура ДНК: Двойная спираль, которая удерживается за счёт водородных связей между комплементарными азотистыми основаниями.
Хроматин – комплекс белка с ядерной ДНК. n 2/3 хроматина –белки. 1/3 хроматина – ДНК. n в хроматине содержится до 10% РНК. Белки, связывающиеся с ДНК делятся на 2 группы: n гистоны, n негистоновые белки. n
Уровни организации хроматина
Уровни организации хромосомы
Гистоны n n n Молекулярная масса 20 000. Хроматин содержит 5 типов гистонов: Н 2 А, Н 2 В, Нз, Н 4 (нуклеосомные гистоны), Н 1. Нуклеосома - фрагмент ДНК, взаимодействующий с комплексом гистонов.
Гистоны Н 1 связываются с ДНК в межнуклеосомных участках (линкерных последовательностях) и защищают эти участки от действия нуклеаз.
Гистоны
Негистоновые белки n n регуляторные белки, участвующие в матричном биосинтезе.
Строение РНК Первичная структура РНК: порядок чередования рибонуклеозидмонофосфатов в полинуклеотидной цепи. Вторичная структура РНК: За счёт водородных связей между комплементарными азотистыми основаниями образуются спирализованные петли – «шпильки» .
Гибридизация n n Данный метод применяют для изучения видовой специфичности нуклеиновых кислот. Метод основан на способности ДНК к денатурации при нагревании (80 -90) и ренатурации при последующем охлаждении.
Репликация воспроизведение (удвоение) молекул ДНК в процессе деления клетки. n процесс синтеза дочерней ДНК на матрице ДНК. Структура дочерней ДНК аналогична родительской ДНК. n
Функции ДНК сохранение генетической информации, n воспроизведение генетической информации, n реализация генетической информации, n
Механизм репликации ДНК– полуконсервативный. В каждой дочерней молекуле одна нить является старой, а другая – вновь синтезированной.
Постулаты Корнберга (1955 г) n n Для синтеза ДНК нужны нуклеозидтрифосфаты. Реакция идёт только в присутствии уже готовой ДНК, выполняющей роль матрицы. Поскольку в молекуле ДНК нуклеотидные остатки образуют пары А-Т и Г-Ц, в реакции расходуются одинаковые количества d. АТФ и ТТФ (стехиометричекий коэффициент m), d. ГТФ и d. ЦТФ(стехиометричекий коэффициент n) Требуется набор ферментов (реплисома).
Синтез нуклеиновых кислот происходит в ядре и митохондриях
Этапы репликации. Инициация репликации происходит в нескольких точках хромосомы. Точки инициации репликации- ориджины репликации.
Во время миграции репликативной вилки происходит разделение цепей родительской ДНК с участием ДНК-хеликазы.
Далее действует раскручивающий белок.
n n n ДНК-полимераза α катализирует синтез короткого (до 10 нуклеотидов) олигонуклеотида, то есть праймера, с которого начинается синтез ДНК. Затем на конец одной цепи присоединяется ДНК-полимераза δ (дельта). Расположение оснований в двух нитях не только комплементарно, но и антипараллельно.
Элонгация репликации – репликация обеих материнских цепей ДНК и связывание друг с другом фрагментов новообразованных цепей ДНК. n n n n Обе дочерние молекулы сохраняют связь с родительской. Хромосома имеет форму вилки. Обе цепи реплицируются одновременно, хотя имеют разное направление. Рост дочерних цепей должен происходить в противоположных направлениях. Синтез новых цепей идёт в направлении от 5`- к 3`- концу. На одной репликативной вилке синтезируются непрерывная нуклеотидная цепь, на другой – фрагменты Оказаки, которые потом соединяются ДНК-лигазой. Элонгация завершается отделением праймеров, формированием дочерней цепи ДНК.
Элонгация репликации Терминация наступает, когда исчерпана ДНК-матрица.
После завершения репликации происходит метилирование нуклеотидных остатков вновь образованных цепей ДНК. n На каждом конце хромосомы присутствует специфическая нуклеотидная последовательность (GGG ТТА-теломерная ДНК). Это нужно для сохранения генетической информации. n С каждым клеточным циклом ДНК хромосом будет последовательно укорачиваться. n
Теломераза обеспечивает восстановление недореплицированных 5`-концов.
Схема удлинения 3`-конца ДНК с помощью РНКсодержащего фермента теломеразы.
Ферменты репликации n n n ДНК-топоизомераза (нуклеаза) разрывает цепь ДНК (3`-5`-фосфодиэфирную связь), а в конце репликации зашивает надрезы. ДНК-хеликаза расплетает двойную спираль ДНК. Белки, дестабилизирующие спираль, связываются с одноцепочечной ДНК и предотвращают комплементарное скручивание матричных цепей.
ДНК-полимеразы n n n имеют цинк в активном центре, для реакции необходим магний. ДНК-полимераза α синтезирует РНК (праймер, затравка) длиной до 10 нуклеотидов. ДНК-полимераза δ продолжает синтез новой непрерывной цепи в направлении от 5`- к 3`- концу (лидирующая цепь). ДНК-полимераза α и ε ведут синтез фрагментов Оказаки на отстающей цепи. Каждый фрагмент Оказаки состоит из 100 нуклеотидов, содержит праймер, который удаляет ДНКполимераза β. ДНК-лигаза соединяет разрывы отстающей цепи ДНК.
Механизм действия ДНК-полимеразы
Расположение ферментов репликации
Репарация ошибок и повреждений ДНК n n Молекула ДНК подвергается спонтанным (ошибки репликации) и индуцированным повреждениям (УФО, радиация, химические вещества). Снижение активности ферментов репарации приводит к накоплению повреждений (мутаций) в ДНК.
Деградация и репарация ДНК n n Дефектная область одной цепи ДНК может быть исправлена по неповреждённой комплементарной цепи. Одноцепочечные разрывы ДНК, вызванные ионизирующей радиацией, может быть репарированы прямым лигированием или рекомбинацией.
Ферменты репарации n ДНК-N-гликозидазы обнаруживают и удаляют повреждённые основания ДНК. n ДНК-инсертаза присоединяет основания к дезоксирибозе. n Эндонуклеаза определяет повреждения и гидролизует 3`-5`-фосфодиэфирную связь. n Экзонуклеаза находит место разрыва цепи и удаляет повреждённый участок. n ДНК-полимераза β достраивает повреждённую нуклеотидную цепь. n ДНК-лигаза соединяет неповреждённый и вновь синтезированный участки цепи ДНК.
Репарация ДНК по механизму вырезания нуклеотидов
Синтез ДНК на матрице РНК (обратная транскрипция) n Фермент обратная транскриптаза (ревертаза, РНК-зависимая ДНК-полимераза) был обнаружен в 1970 году Балтимором и Теминым.
Обратная транскриптаза Сначала синтезирует РНК-ДНК-гибрид. n Затем фермент РНКаза Н удаляет РНК-цепь, n оставшаяся ДНК-цепь служит матрицей для синтеза второй цепи ДНК. n Возникает двухцепочечная ДНК-копия, содержащая информацию, первично представленную в виде РНК-генома ретровируса. n
Транскрипциясинтез РНК на матрице ДНК. РНК р-РНК т-РНК – составляет 15%, - молекулярная масса 30 000, - существует несколько дней. и-РНК – составляет 2 - 5%, - молекулярная масса 500 000, - существует недолго. – составляет 80%, - молекулярная масса 5 млн. , - существует несколько недель.
т-РНК n n n ЦЦА конец соответствует месту присоединения АМК, Псевдоуридиновая петля обеспечивает связывание аминоацил-т. РНК с поверхностью рибосомы. Дигидроуридиновая петля – место для узнавания специфического кодона. Антикодон – специфичен и комплементарен кодону м. РНК. Минорные основания в антикодоне играют роль в гибкости считывания согласно гипотезе неоднозначност соответствия.
Структура т-РНК
n n Синтез идёт из нуклеозидтрифосфатов. В синтезе участвует ДНК-зависимая-РНК-полимераза. Синтез РНК идёт в направлении от 5`к 3`-концу. Фермент присоединяется к участку ДНК (промотору). На матрице ДНК комплементарно строится полирибонуклеотид, являющийся копией первичной структуры ДНК.
Промотор n n РНК-полимераза связывается с одной цепью нативной молекулы ДНК в определённой точке (промоторе), вызывая расплетение двойной спирали, где и происходит синтез. РНК-полимераза I участвует в синтезе пре-р. РНК-полимераза II - в синтезе пре-м. РНК-полимераза III - в синтезе пре-т. РНК.
Транскрипциябиосинтез матричных РНК.
Экспрессия генов (поток генетической информации) включает транскрипцию и трансляцию. Отличия транскрипции от репликации: n не требует синтеза праймера, n использует не всю молекулу ДНК, а отдельные её сегменты, n требует наличия одной из цепей ДНК в качестве матрицы, которая полностью сохраняется, n при транскрипции транскрибируются отдельные гены или группы генов, а при репликации кодируется вся родительская ДНК.
м-РНК n n n переносит информацию от ДНК в ядре до цитоплазмы, где она соединяется с рибосомами и служит матрицей, на которой происходит синтез белка, короткоживущая, локализована в ядре и цитоплазме, одноцепочечная, комплементарна одной из цепей ДНК
Расположение функциональных участков на молекуле м-РНК
В транскрипции различают три фазы инициация, n элонгация, n терминация. Элонгация идёт в направлении от 5`- к 3`- концу антипараллельно матричной цепи ДНК. Активация промотора происходит с помощью белкового фактора – ТАТА. Транскриптон - участок ДНК, ограниченный промотором и сайтом терминации. У эукариотов в состав транскриптона входит один ген. n
Процесс транскрипции
Посттранскрипционный процессингферментативные превращения транскриптов, после чего они стают активными. Процессинг включает: n кэпирование, n сплайсинг, n полиаденилирование, n метилирование.
Посттранскрипционный процессинг м-РНК
Кэпирование присоединение остатка 7 -метилгуанозина к 5`- концу молекулы и-РНК, что защищает РНК от ферментативного распада. n
Полиаденилирование присоединение фрагментов АА УАА к 3`- концу и-РНК в ядре или цитоплазме. n Это облегчает выход и-РНК из ядра и замедляет гидролиз в цитоплазме. n
Сплайсинг генов n В ядре происходит сплайсинг генов – ферментативное присоединение одного гена или части гена к другому, а также процесс удаления интронов и соединения экзонов при синтезе м-РНК.
Механизм сплайсинга
n n n Эукариотические гены имеют фрагментарное строение: они состоят из нескольких значащих участков (экзонов), разделённых нетранслируемыми вставками (интронами). Экзон – участок гена, транскрипт которого оказывается в зрелой м-РНК. Он кодирует участок цепи белка. Интрон – вставочная последовательность в гене, которая транскрибируется, но вырезается до трансляции.
Система экзонов и интронов в гене
Сплайсосома координирует сплайсинг. Сплайсосома- комплекс малых ядерных РНК и белков (малых ядерных нуклеопротеинов). Регуляторные сигналы при транскрипции n Энхансеры повышают уровень транскрипции. n Силансеры ослабляют уровень транскрипции. Энхансеры и силансеры – участки в нетранскрибируемых последовательностях генома. n Рибозимы катализируют сам сплайсинг. n
Контроль на уровне транскрипции
Посттранскрипционная модификация т-РНК n у т-РНК на 3`-конце формируется акцепторный участок, а в средней части молекулы – антикодон.
Посттранскрипционная модификация пре-р. РНК n В ходе посттранскрипционной модификации пре-р. РНК и связывания со специфическими белками образуется рибосома.
Рибосомы – нуклеопротеиды. n n n Рибосомы характеризуют по скорости их седиментации в центрифужном поле, которая количественно выражается константой седиментации S , выражаемой в единицах Сведберга. 80 S – рибосомы эукариот. Они содержат равное количество белка и РНК. 70 S - рибосомы прокариот. Соотношение РНК : белок = 2: 1.
Рибосома состоит из двух субчастиц (30 S + 50 S). В меньшей субъединице содержится 20 белков. n В большей содержится 30 белков. На большой субъединице находятся 2 центра: А и Р. n
Структура субчастиц рибосом
Полисома объединяет 4 -5 рибосом вместе с м-РНК.
Генетический код – способ записи информации об аминокислотах с помощью нуклеотидов.
Свойства генетического кода. n Триплетность. Одна АМК кодируется тремя нуклеотидами. n Вырожденность. Несколько кодонов кодируют одну и ту же АМК. Однозначность и специфичность. Каждому кодону соответствует одна АМК. Неперекрываемость. Отсутствие знаков препинания. Считывание триплетов идёт без пропусков. Универсальность. Среди 64 кодонов – 3 кодона нонсенс (УАГ, УАА, УГА) бессмысленные. Неоднозначность соответствия в считывании кодонов. Строгая комплементарность в двух первых буквах кодона, в случае же третьей буквы это необязательно. n n n
Аминоацил-т. РНК-синтетазы имеют три центра связывания: n для АМК, n для т-РНК, n для АТФ.
Активация аминокислоты Требуется: n аминокислота, n т-РНК, n АТФ, n ионы магния, n кодазы. Комплекс аминоацил-т. РНК
Активация аминокислоты
Схема образования аминоацил-т. РНК
Трансляция – синтез белка на матрице РНК. n n n ДНК – код АТГ, и-РНК – кодон УАУ, т –РНК – антикодон АУГ.
Этапы трансляции n n n инициация, элонгация, терминация.
Инициация Инициирующий кодон – АУГ. n Рост цепей идёт с N-конца. n Синтез начинается с Nформилметионина. Необходимые компоненты: n рибосомы, n инициирующий кодон, n инициаторная аминоацил-т. РНК, n факторы инициации (IF 1, IF 2, IF 3), n ГТФ, n ионы магния.
n n n Процесс формилирования предотвращает участие аминогруппы АМК в образовании пептидной связи и обеспечивает синтез белка в направлении от аминогруппы к карбоксильной. IF 3 первым связывается с малой субъединицей рибосомы. IF 3 обеспечивает узнавание участка на м-РНК, куда присоединяется формилметионин-т. РНК. IF 1 способствует связыванию формилметионин -т. РНК с малой субъединицей рибосомы и присоединению к ней м-РНК. IF 2 способствует объединению большой и малой субчастиц.
Образование инициаторного комплекса Осуществляется путём присоединения белковых факторов, формилметионин-т. РНК, ГТФ к малой субчастице рибосомы, к которой комплементарно антикодону присоединяется м-РНК, при участии кодона АУГ. n После присоединения 50 S субчастицы рибосома становится функционально активной. n
Расположение функциональных центров на малой и большой субчастицах рибосомы
Элонгация трансляции Необходимо: n т-РНК, n АМК, n ГТФ, n ионы магния, n рибосомы, n факторы элонгации, n м-РНК
n n n n Формилметионин-т. РНК поступает сначала на А-центр, а потом на Р-центр. Участок А получает другую АМК. Для этого необходим ГТФ. Рибосома делает «шаг» по м-РНК на один кодон. Формилметионин переходит на А-участок с Р-участка. На А-участке происходит синтез пептидной связи под влиянием пептидилтрансферазы. Рибосома перемещается на один кодон. Дипептид вновь переносится на Р-участок под влиянием пептидилтранслоказы. На А-участок поступает третья АМК. При перебросе в участок А дипептида образуется трипептид.
Элонгационный цикл
Реакция транспептидации
Главное событие транслокации – перемещение пептидил-т. РНК из А в Р-участок рибосомы. n Антикодон тянет за собой кодон матрицы, приводя к перемещению матрицы на один триплет относительно рибосомы. n
Для синтеза одной пептидной связи нужно 4 АТФ: 2 АТФ - на активацию АМК и 2 ГТФ - на включение АМК т-РНК в А-центр и транслокацию.
Терминация Необходимы: n рибосомы, n факторы терминации (3), n м-РНК, n терминирующие кодоны УАГ, УАА, УГА. От рибосомы отделяется белок, т-РНК, м-РНК распадается до рибонуклеотидов.
Терминация трансляции
Синтез митохондриальных белков n n 2% клеточной ДНК находится в митохондриях. Белки, синтезируемые в митохондриях, нерастворимы и участвуют в организации структуры митохондрий.
Посттрансляционная модификация n n формирование третичной и четвертичной структур – фолдинг (участвуют шапероны), ограниченный протеолиз. присоединение коферментов, простетической группы, гликозилирование, метилирование, гидроксилирование, фосфорилирование, образование дисульфидных связей.
Ингибиторы белкового синтеза n n n 50% антибиотиков являются ингибиторами белкового синтеза, 20% - антибиотиков ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот. Репликацию нарушают антибиотики, химические яды, вирусы.
Ингибиторы репликации Антибиотики (новобиоцин, митомицин) n Аналоги азотистых оснований и нуклеозидов (5 -бромурацил, 5 фтордезоксиурацил) n Алкилирующие агенты (иприт) n Мутагены (уретан, гидроксиламин, азотистая кислота и др. ) n
Ингибиторы синтеза нуклеотидов применяются при лечении лейкозов, n опухолей, n вирусных заболеваний. Они прекращают репликацию ДНК и деление клеток. n
Аналоги нуклеозидов (ИДУ) применяют при лечении вирусных гепатитов. n n ИДУ отличаются от тимидина лишь тем, что у 5 углеродного атома метильная группа заменена на атом йода. Блокируется синтез ДНК.
Аметоптерин n n структурный аналог фолиевой кислоты, ингибирует дегидрофолатредуктазу, конкурирует с фолиевой кислотой за фермент, так как структурно похож на неё, но коферментом быть не может. Он ингибирует перенос одноуглеродных остатков, необходимых для синтеза нуклеиновых кислот, содержащихся в клетках белой крови и тем самым снижает их число, резко повышенное при ряде форм острого лейкоза.
Ингибиторы транскрипции Антибиотики n Аналоги нуклеозидов (кордицепин, цитозинарабинозид) n Алкалоиды (винкристин, винбластин – противоопухолевые препараты) n Яды и токсины n
Ингибиторы трансляции n Антибиотики. Тетрациклин тормозит связывание аминоацилт. РНК с А-центром в рибосоме. Эритромицин тормозит активность пептидилтранслоказы в процессе трансляции, Хлоранфеникол ингибирует пептидилтрансферазу. n Яды и токсины (дифтерийный токсин, токсины грибов).
Действие антибиотиков на белковый синтез
Влияние облучения на синтез белков n n Наиболее чувствительны ткани в состоянии митоза (костный мозг, эпителий кишечника). Наиболее устойчивы - клетки ЦНС. Если повреждаются соматические клетки, то они гибнут или укорачивается срок их жизни. В половых клетках изменения передаются по наследству.
При облучении активируется СРО n n n гибель клетки, мутации, торможение деления.
Действие на репликацию n n мутации типа делеции, нарушается связь ДНК с гистоновыми и негистоновыми белками, хромосомные аберрации, тормозится репарация ДНК.
Влияние облучения на транскрипцию. n n подавление активности ферментов транскрипции, нарушение процессинга РНК. Влияние облучения на трансляцию. n n n тормозится сборка инициаторного комплекса, происходит сборка белка с изменённой первичной структурой, появляются функционально неполноценные белки
Мутации – разнообразные изменения генома. n n n Мутагены – вещества, вызывающие изменения в генах. Обычно зародыш с изменёнными генами организм матери отторгает (выкидыши составляют 15% исходов беременностей). Каждый человек несёт в геноме рецессивные мутации. Наследственные заболевания среди новорожденных составляют 4 -6%.
Действие мутагенов
n n Точечные мутации – в ДНК изменён один нуклеотид. Транзиция – изменение последовательности нуклеотидных пар. АТ ГЦ. Трансверсия (перевёрты). АТ ТА. Вставка нуклеотидов. Делеция – выпадение нуклеотидов.
Антимутагены в-каротин, n витамины А, С, Е, n селен (чеснок, макароны, молоко, морские продукты). n
Генная инженерия – прикладное направление молекулярной генетики, исследующее возможности и способы создания лабораторным путём генетических структур и наследственно изменённых организмов. n Генная инженерия подготавливает переход медицины на новый, более высокий уровень её развития и расширяет возможности профилактики и лечения многих заболеваний человека.
Цели генной инженерии n n Генетическая модификация микроорганизмов для увеличения количества и улучшения качества изначально вырабатываемого данным организмом продукта. Перенос генов млекопитающих и человека в микроорганизмы (бактерии, дрожжи) для синтеза с их помощью специфических белков (гормонов, вакцин, интерферона, ферментов). Генетическая модификация высших растений для увеличения их продуктивности. Генетическая модификация соматических клеток человека с наследственными заболеваниями.
Достижения генетической инженерии n n n С помощью бактерий синтезирован соматотропин, инсулин. Воспроизведён синтез E. Coli человеческого а-интерферона. Получена безопасная вакцина против ящура.
Синтез инсулина при помощи методов генной инженерии
Скачать презентацию Матричные биосинтезы Матричные биосинтезы n n При
Матричные биосинтезы.ppt