МАТЕРИАЛ ДЛЯ ПОДГОТОВ КИ К

МАТЕРИАЛ ДЛЯ ПОДГОТОВ КИ К ЭКЗАМЕНУ ПО ЦИТОЛОГИИ Профессор Замулаева И. А.

Блок 1. Методы цитологии. Клеточная теория. Методы изучения клетки: • Световая микроскопия • Флуоресцентная микроскопия • Электронная микроскопия • Иммуноцитохимия • Проточная цитометрия • Ультрацентрифугирование

Блок 1. Методы цитологии. Клеточная теория. Световая микроскопия Разрешающая способность – минимальное расстояние между двумя точками, которые видны раздельно Разрешающая способность микроскопа: 0, 61 λ d= n. sin α где: λ –длина волны света, используемого для освещения объекта n- коэффициент преломления среды α – угол между оптической осью объектива и наиболее отклоняющимся лучом, попадающим в объектив

Блок 1. Методы цитологии. Клеточная теория. Рабочие диапазоны светового и электронного микроскопов

Блок 1. Методы цитологии. Клеточная теория. Основные положения клеточной теории в современном виде: • Клетка – элементарная единица живого; • Клетки всех организмов принципиально сходны между собой по строению, функции, химическому составу; • Клетки размножаются только путем деления исходной клетки; • Клетки хранят, перерабатывают и реализуют генетическую информацию; • Многоклеточные организмы являются сложными клеточными ансамблями, образующими целостные системы, которые связаны друг с другом с помощью химических факторов, гуморальных и нервных; • Клетки многоклеточных организмов тотипотентны, т. е. обладают генетическими потенциями всех клеток данного организма. Это положение означает, что клетки несут одинаковую генетическую информацию, но отличаются экспрессией (работой) разных генов, что и обеспечивает их морфологическое и функциональное разнообразие.

Блок 2. Поверхностный аппарат клеток. Как и внутриклеточные мембраны, плазматическая мембрана состоит из белков, липидов и углеводов. Соотношение этих компонентов может варьировать в разных клетках в широких пределах. Но в среднем эти компоненты находятся в весовом соотношении около 60%: около 40%: менее 1% соответственно.

Блок 2. Поверхностный аппарат клеток. Плазмалемма, как и все мембраны, характеризуется 3 основными свойствами: 1. Структурная основа любой мембраны – двойной слой липидов (липидный бислой) 2. Эти слои различаются по составу, т. е мембрана ассиметрична 3. Мембрана – подвижная, текучая структура, т. е. её молекулы способны перемещаться в плоскости мембраны

Плазматическая мембрана обеспечивает такие свойства клеток, как: 1) адгезия; 2) рецепция; 3) избирательная проницаемость; 4) эндо- и экзоцитоз

Внешний углеводный слой - гликокаликс В состав гликокаликса входят гликопротеины и гликолипиды.

Блок 2. Поверхностный аппарат клеток. Через мембрану транспортируются молекулы с малым и большим молекулярным весом, а также частицы, части клеток или даже целые клетки. Транспорт «малых» молекул и «больших» молекул (или частиц) осуществляется разными способами.

Блок 2. Поверхностный аппарат клеток. Транспорт малых молекул Существует 2 основных механизма транспорта через мембрану малых молекул: пассивный и активный транспорт. В случае пассивного транспорта перенос веществ происходит по градиенту концентрации и не требует затрат энергии. В случае активного транспорта все наоборот: транспорт происходит против градиента концентрации и для него необходима энергия.

Блок 2. Поверхностный аппарат клеток. Относительная проницаемость искусственного липидного бислоя для различных классов молекул

Эксперименты с мембранами естественного происхождения показали, что ионы все-таки проникают через мембрану, а скорость проникновения воды много выше, чем можно было бы ожидать, исходя из простой физической диффузии этих молекул через искусственные бислои. То же самое можно сказать и о проникновении через клеточные мембраны аминокислот, сахаров, нуклеотидов, которые через искусственные мембраны проходят чрезвычайно медленно. Причина этого несоответствия – в наличии в клеточной мембране специальных транспортных белков , через которые внутрь клетки проникают указанные молекулы и ионы.

Блок 2. Поверхностный аппарат клеток. По механизму работы транспортные белки разделяются на каналообразующие белки и белки-переносчики. Каналообразующие белки – трансмембранные белки, пронизывающие мембрану несколько раз насквозь, в результате чего внутри образуется полость, изолирующая переносимое вещество от липидного бислоя, что и обеспечивает саму транспортировку. Некоторые каналообразующие белки открыты постоянно. Другие каналы открываются в ответ на изменение заряда мембраны или связывания с лигандами.

Блок 2. Поверхностный аппарат клеток. Белки-переносчики тоже являются трансмембранными белками, но работают они по-другому. Принцип работы белков-переносчиков получил название «пинг-понг» .

Блок 2. Поверхностный аппарат клеток. Таким образом, пассивный транспорт может осуществляться путем простой диффузии (физическая диффузия через липидный бислой, диффузия через каналообразующие белки) и путем облегченной диффузии (с помощью белков-переносчиков).

Блок 2. Поверхностный аппарат клеток. Транспорт макромолекул и частиц Транспорт больших молекул осуществляется принципиально другим способом (по сравнению с транспортом малых молекул)– путем везикулярного переноса. При этом транспортируемые вещества упаковываются в пузырьки – везикулы – и выводятся из клетки или поглощаются клеткой. Этот процесс энергозависим, поэтому его можно отнести к активному транспорту.

Блок 2. Поверхностный аппарат клеток. Эндоцитоз, включая пино- и фагоцитоз, может быть неспецифическим (постоянным, конститутивным) и специфическим (рецепторным).

Блок 2. Поверхностный аппарат клеток. Эндоцитоз (как специфический, так и неспецифический) происходит не по всей клеточной поверхности, а только в определенных участках. Эти специализированные участки называют окаймленными ямками. Электронно-микроскопическая фотография окаймленных ямок ооцитов курицы (в процессе интенсивного поглощения белка)

Блок 2. Поверхностный аппарат клеток. Варианты межклеточных взаимодействий Непрямое Прямое взаимодействие клеток взаимодействие клеток на расстоянии Постоянные Временные межклеточные соединения контакты

Блок 2. Поверхностный аппарат клеток. Варианты межклеточных взаимодействий Непрямое Прямое взаимодействие клеток взаимодействие клеток на расстоянии Временные межклеточные Постоянные межклеточные соединения контакты Простые соединения Сложные соединения Адгезионные Проводящие Собственно Соединения соединения – Замыкающие соединения простые типа десмосомы соединения (по разному)*: контакты замка (точечные, (мембраны щелевые (2 -4 нм) (15 -20 нм)* (15 -20 нм)* полудесмосомы, вплотную)* синапсы (20 -30 нм) опоясывающие) плазмодесмы (25 -30 нм)* (40 -50 нм)

Блок 2. Поверхностный аппарат клеток. Адгезионные соединения (схема строения десмосомы)

Блок 2. Поверхностный аппарат клеток. Замыкающие контакты (= плотные, изолирующие)

Блок 2. Поверхностный аппарат клеток. Проводящие соединения (схема строения щелевого контакта)

Блок 2. Поверхностный аппарат клеток. Классификация сигнальных молекул по дальности действия Расстояние прямого контакта (щелевое соединение)

Блок 2. Поверхностный аппарат клеток. По химическим свойствам сигнальные молекулы разделяются на гидрофильные и гидрофобные. Важное биологическое различие между этими молекулами: срок жизни в организме и механизм действия на клетку.

Блок 2. Поверхностный аппарат клеток. Что происходит дальше – после взаимодействия поверхностного рецептора с сигнальной молекулой? Как клетка отвечает на сигнал, если сама сигнальная молекула не проникает внутрь клетки? Рецепторы, находящиеся на поверхности, плазматической мембраны могут быть разделены на 3 основных группы по механизму действия: • Рецепторы, образующие канал. • Каталитические рецепторы. . • Рецепторы с непрямым действием.

Блок 2. Поверхностный аппарат клеток. 1. Рецепторы, образующие канал. 2. Пример: чувствительные к нейромедиатору ионные каналы, которые быстро открываются в ответ на связывание с лигандами (как в случае нервно-мышечного синапса).

Блок 2. Поверхностный аппарат клеток. 2. Каталитические рецепторы Рецептор является одновременно также и ферментом, который связав сигнальную молекулу, изменяет свою конформацию , и вследствие этого свою активность. Например, такой рецептор приобретает способность фосфолирировать другие белки, тем самым меняя их функционирование. Пример: рецепторы инсулина, ростовых факторов и др.

Блок 2. Поверхностный аппарат клеток. Общая схема работы каталитических рецепторов Рецептор+лиганд Изменение конформации рецептора Изменение гуанилатциклазной активности рецептора Изменение протеинкиназной активности рецептора Увеличение количества ц-ГМФ Активация протеинкиназы G Фосфолирирование других белков Изменение свойств этих белков = Изменение функционирования самой клетки

Блок 2. Поверхностный аппарат клеток. 3. Рецепторы с непрямым действием Такие рецепторы после связывания с сигнальной молекулой активируют т. н. G-белки плазматической мембраны, которые в свою очередь активируют или ингибируют аденилатциклазу и др ферменты. Аденилатциклаза занимается тем, что из АТФ синтезирует ц. АМФ. Ц-АМФ, в свою очередь, является универсальным регулятором многочисленных внутриклеточных процессов (наряду с другими регуляторами). Пример: опиоидные рецепторы.

Блок 2. Поверхностный аппарат клеток. Итог: во всех 3 -х случаях после связывания рецептора с сигнальной молекулой происходит каскад внутриклеточных биохимических реакций. В результате клетка начинает функционировать по- другому (т. о. , отвечает на сигнал).

Блок 3. Ядерный аппарат клеток. Основу ядерного аппарата составляет ДНК, которая выполняет три основные функции: хранение, переработка генетической информации и её передача в ряду клеточных поколений.

Блок 3. Ядерный аппарат клеток. Основные отличия ядерного аппарата про- и эукариот № Характеристика Прокариоты Эукариоты /признак 1 Ядерная оболочка Нет Есть 2 Молекула ДНК 1 кольцевая/клетку Несколько линейных/клетку, (число молекул, форма) составляющих основу хромосом 3 Количество ДНК/клетку Относительно мало (до Значительно больше 107 н. п. /гаплоидный (в среднем 109 н. п) геном) 4 Количество Очень мало Составляет большую часть нетранскрибируемой ДНК ( «избыточной» ) 5 Наличие Нет Есть нетранслируемых участков (интронов) внутри 1 гена 6 Наличие Практически нет Много повторяющихся участков ДНК 7 Тип репликации ДНК Унирепликонный Мультирепликоный 8 Суперкомпактизация Невысокая (до 1000 раз) Крайне высока, особенно в ДНК митотических хромосомах. Осуществляется помощью специальных белков, достигает сотен тысяч раз.

Блок 3. Ядерный аппарат клеток. Суперкомпактизация ДНК про- и эукариот находится в клетке в сверхспирализованном состоянии. Это означает, что двойная спираль ДНК многократно складывается с помощью специальных белков и в результате занимает значительно меньше места. Степень компактизации ДНК про- и эукариот различается. У первых достигает 1000 раз, у вторых – сотен тысяч раз. Для эукариот компактизация ДНК особенно важна по двум причинам. Во-первых она позволяет упорядоченно расположить очень длинные молекулы ДНК в небольшом объеме клеточного ядра. Во-вторых, это один из способов контроля экспрессии генов: характер упаковки ДНК влияет на активность некоторых участков генома.

Строение ядерного аппарата вообще и ДНК, в частности, у эукариот намного сложнее, чем у прокариот. Для чего вообще нужна эта сложность и какие преимущества она может дать? Главное: наличие обособленного ядра дает возможность разделить во времени и пространстве процессы транскрипции и трансляции. В конечном итоге появляются разнообразные возможности регулировать эти процессы, а, следовательно, и обеспечить огромное разнообразие самих клеток, несущих одинаковую генетическую информацию.

Блок 3. Ядерный аппарат клеток. Ядро состоит из нескольких частей: 1. Ядерная оболочка 2. Хроматин 3. Ядерный матрикс 4. Ядрышко 5. Кариоплазма

Блок 3. Ядерный аппарат клеток. Хроматин – основная структура ядра- содержит ДНК, РНК, белки. Теория структурной непрерывности хромосом в клеточном цикле (Бовери, 1887). В современном виде она может быть сформулирована следующим образом: материал хромосом сохраняет свою структурную целостность на протяжении жизни клетки, но меняет сложность и степень упаковки. Хромосома может находиться в 2 -х состояниях: конденсированном при делении, деконденсированном полностью или частично в остальное время.

Различные уровни компактизации хроматина И в интерфазе (между делениями) и в митозе Только во время митоза

Блок 3. Ядерный аппарат клеток. Отличительные особенности гетеро – и эухроматина № Отличительная особенность гетерохроматин эухроматин 1 Степень конденсации высокая низкая 2 Связь с ядерной оболочкой прочная не прочная или не прослеживается 3 Синтез РНК (транскрипция) практически не происходит активно 4 Репарация повреждений ДНК менее более эффективная 5 Репликация как правило, первоочередная поздняя 6 Количество высокоповторя- много больше значительно ющихся последовательностей меньше нуклеотидов

Блок 3. Ядерный аппарат клеток. Гетерохроматин является неактивной частью хромосом! Различают факультативный и конститутивный гетеро. ХТ. Постоянно конденсированные участки хромосом в интерфазных ядрах называют конститутивным гетеро. ХТ. Он представлен теломерными, прицентромерными и интеркалярными (вставочными) зонами митотических хромомосом. Функциональное значение конститутивного гетеро. ХТ до конца не выяснено. Предполагают, что он несет ряд важных функций, связанных со спариванием гомологов в мейозе, с поддержанием общей структуры интерфазного ядра, с прикреплением ХТ к ядерной оболочке, с некоторыми регуляторными функциями. Факультативным гетеро. ХТ называют участки интерфазных хромосом, которые в одних клетках находятся в конденсированном состоянии (в составе гетеро. ХТ), в других – в транскрипционно активном, деконденсированном состоянии (в составе эу. ХТ).

Блок 3. Ядерный аппарат клеток. Биологический смысл ядерной оболочки СХЕМА, иллюстрирующая 5 уровней, на которых может осуществляться контроль экспрессии генов у эукариот

Блок 3. Ядерный аппарат клеток. Ядерные поры осуществляют чрезвычайно важную функцию ядерно- цитолазматического обмена. Поры осуществляют указанный обмен, регулируют это процесс, причем не просто переносят вещества из ядра в цитоплазму и наоборот, но выполняют роль сортировщика, узнающего и отбирающего переносимые молекулы.

Блок 3. Ядерный аппарат клеток. Функции ядерной оболочки: • Пространственное разделение ядра и цитоплазмы, что приводит к обособлению процессов синтеза РНК и белков и, таким образом, создает дополнительные (по сравнению с прокариотами) возможности для регуляции генной активности; • Пассивный и активный (в том числе специфический) транспорт из ядра в цитоплазму и наоборот; • Закрепление некоторых участков хромосом, что обеспечивает организацию трехмерной структуры хроматина в интерфазных ядрах или в случае закрытого митоза равномерное распределение хромосом по дочерним клеткам.

Блок 3. Ядерный аппарат клеток. ЯДРЫШКО • Все типы р-РНК синтезируются в ядрышке (кроме 5 S).

Блок 3. Ядерный аппарат клеток. Особая организация генов р- РНК (всех кроме 5 S) • Каждый ген несет информацию сразу о трех молекулах р-РНК (28 S, 18 S и 5, 8 S). • Гены, кодирующие р-РНК, многократно повторены и расположены кластерно. • У разных видов кластеры могут находиться в одной хромосоме или в нескольких ( у человека в пяти хромосомах – 13, 14, 15, 21 и 22). Кодирующие участки (у человека их 200 -600) Нетранскрибируемые спейсеры

Схема образования рибосомных субъединиц в ядрышке Ядрышковый организатор – это участок хромосомы, где образуется р-РНК.

Блок 3. Ядерный аппарат клеток. Основные типы строения ядрышек Ретикулярный тип -самое активное ядрышко (нуклеолонемное строение с обилием гранулярного и фибриллярного компонентов) Компактный тип – активное ядрышко, характерное для активно размножающихся клеток (нет нуклеолонем, но фибриллярный и гранулярный компоненты выражены хорошо) Кольцевидный тип – менее активное ядрышко, характерное для дифференцирован- ных клеток (мелкое около 1 мкм, грануляр- ный компонент выражен хуже и не занимает отдельной зоны) Остаточный тип – неактивное, характерное для клеток, которые не синтезируют белок (только фибриллярный центр, нет ни гранулярного, ни фибриллярного компонентов, окружено гетерохроматином)

Блок 4. Цитоскелет. Цитоскелет - опорно-двигательная система, располагающаяся в цитоплазме эукариотических клеток и состоящая из сети белковых нитей (филаментов). Цитоскелет представлен, в основном, тремя структурами: • микрофиламентами (диаметр 5 -7 нм); • микротрубочками (диаметр 24 -28 нм); • промежуточными филаментами (диаметр 10 нм).

Блок 4. Цитоскелет. Микрофиламенты состоят из основного (актина) и вспомогательных белков (миозина, альфа-актинина, тропомиозина и других). Расположение вспомогательного белка - тропомиозина Схема строения актинового филамента

Блок 4. Цитоскелет. Микротрубочки Микротрубочка представляет собой полый цилиндр, состоящий из основного белка тубулина (80%). Остальные 20% приходятся на вспомогательные т. н. MAP (microtubule- associated proteins) – белки, связанные с микротрубочками, и тау- фактор.

Блок 4. Цитоскелет. Промежуточные филаменты • В эпителиальных тканях - кератины • В соединительной ткани – виментин • В мышечной – десмин • В нервной –нейрофиламенты Основная функция промежуточных филаментов – скелетная.

Блок 4. Цитоскелет. Цитоскелет (общая схема) Микрофиламенты Микротрубочки Промежуточные образуют: располагаются филаменты -нити натяжения, поодиночке или располагаются -сеть под мембраной, образуют: поодиночке, -специализированные специализированные внутриклеточных структуры специализированных (микроворсинки, (реснички, жгутики, структур, как правило, стереоцилии, базальные тельца, не образуют. саркомеры скелетных центриоли, веретено мышц и др. ) деления др. ) Стабильны, химически Лабильны, химически неустойчивы, чрезвычайно устойчивы, эволюционно консервативны разнообразны

Блок 4. Цитоскелет. Функции цитоскелета: • Поддержание и изменение формы клеток; • Участие в образовании временных и постоянных межклеточных контактов; • Движение клеток, в том числе за счет работы специализированных структур (ресничек, жгутиков); • Движение внутриклеточных структур (органелл, хромосом); • Образование специальных структур клетками многоклеточных организмов (реснитчатые эпителии, мышцы, микроворсинки кишечного эпителия, стерецилии).

Блок 5. Вакуом. ВАКУОЛЯРНАЯ СИСТЕМА Основные органоиды: • эндоплазматический ретикулум (ЭПР), • аппарат Гольджи (АГ), • секреторные вакуоли, • лизосомы, • растительные вакуоли, • пероксисомы

Блок 5. Вакуом. Функции г-ЭПР • участие в синтезе белков 3 -х групп: -экспортируемые белки, -белки плазмалеммы, -белки (ферменты) лизосом и др. • обособление, изоляция этих белков от клеточного содержимого • химическая модификация (созревание) белков транспортировка белков в разные участки клетки • синтез жиров (мембранных липидов) • запасание питательных веществ

Блок 5. Вакуом. а-ЭПР Важной особенностью а-ЭПР является его мультифункциональный характер: Помимо транспортной, изолирующей функции и синтеза мембранных липидов (что происходит также и в г-ЭПР), а-ЭПР может транспортировать и накапливать ионы, осуществлять детоксикацию вредных проуктов и синтезировать немембранные липиды, например предшественники стероидных гормонов

Аппарат Гольджи – сильно поляризованная структура: на одном его конце происходит образование цистерн, на другом – отшнуровка вакуолей и распад цистерн.

Блок 5. Вакуом. Аппарат Гольджи –внутриклеточный сортировщик белков

Блок 5. Вакуом. Функции АГ: • накопление продуктов, синтезированных на рибосомах г-ЭПР • изолирование этих продуктов от цитозоля • химическая модификация (созревание) белков • синтез полисахаридов, их присоединение к белкам • сегрегация белков • выведение готовых секретов за пределы клетки • образование лизосом (органоидов внутриклеточного пищеварения)

Блок 5. Вакуом. Объединенная схема перемещения структур вакуолярной системы

Блок 5. Вакуом. Основные взаимопереходы клеточных мембран Ретроградный транспорт Внешняя Плазма- Секреторные Аппарат ЭПР ядерная лемма вакуоли Гольджи мембрана Эндо- Перокси- Вторичные Первичные лизосомы цитозные вакуоли + лизосомы Растительная вакуоль

Блок 6. Органоиды энергетического обмена. Сходство энергетических процессов в митохондриях и пластидах Трансмембранный электрохимический протонный градиент

Блок 6. Органоиды энергетического обмена. Общий план строения митохондрий

Блок 6. Органоиды энергетического обмена. Основная функция митохондрий – синтез АТФ за счет энергии, извлекаемой из питательных веществ при их расщеплении Внутренняя мембрана митохондрий: 1 - липиды; 2 -флавопротеид; 3 - железосодержащие белки; 4 - цитохром b; 5 - кофермент Q; 6 -9 -цитохромы (a, b, c); 10 -11 – АТФ синтетазный комплекс; 12 – белки-переносчики

Блок 6. Органоиды энергетического обмена. В чем состоит автономия митохондрий? • Наличие собственной ДНК • Репликация м-ДНК осуществляется независимо от я- ДНК Собственный • Наличие всех типов РНК (м-РНК, белок- т-РНК, р-РНК) синтезирующий аппарат • Наличие собственных рибосом • Генетический код м-ДНК несколько отличается от такового у бактерий и я-ДНК • Размножение делением

Блок 6. Органоиды энергетического обмена. В чем заключается относительность автономии митохондрий? • ДНК митохондрий слишком мала, чтобы кодировать все белки, необходимые митохондриям • Большую часть липидов митохондрии получают извне • Биогенез митохондрий контролируется ядерным геномом

Блок 6. Органоиды энергетического обмена. Существует несколько вариантов пластид, представляющих ряд взаимных превращений: • Хлоропласт • Лейкопласт • Хромопласт • Амилопласт Разные пластиды отличаются по строению, пигментному составу и функциям.

Блок 6. Органоиды энергетического обмена. Общий план строения

Блок 6. Органоиды энергетического обмена. 2 СТАДИИ ФОТОСИНТЕЗА: 1. СВЕТОВАЯ ПРОТЕКАЕТ НА МЕМБРАНАХ ТИЛАКОИДОВ И ЗАКЛЮЧАЕТСЯ В СИНТЕЗЕ АТФ ПО МЕХАНИЗМУ ХЕМИООСМОСА 2. ТЕМНОВАЯ ПРОТЕКАЕТ С МАТРИКСЕ (СТРОМЕ) И ЗАКЛЮЧАЕТСЯ В ФИКСАЦИИ УГЛЕРОДА ( В ВИДЕ СО 2)

Механизм синтеза АТФ в хлоропластах принципиально сходен с таковым в митохондриях и бактериях (на рисунке)

Блок 6. Органоиды энергетического обмена. Центральная реакция темновой фазы – превращение неорганического углерода (в виде СО 2) в органический углерод ( в виде 3 -фосфоглицерата) была открыта в 1948 году. Рибулозобифат- карбоксилаза В цикле фиксации углерода на связывание 1 молекулы СО 2 затрачивается 3 молекулы АТФ и 2 молекулы НАДФН.