Масс-спектрометрические методы анализа Масс-спектрометрические методы

Масс-спектрометрические методы анализа • • • Масс-спектрометрические методы анализа основаны на ионизации атомов и молекул и последующем разделении образующихся ионов в пространстве и времени в соответствии с их массовыми числами – отношениями m/z. Первые масс-спектры изотопов неона были получены Дж. Томпсоном (1910 г. ). Ф. Астон из Кембриджа получил в 1922 г. Нобелевскую премию по химии за открытие с помощью масс-спектрографа ряда изотопов нерадиоактивных элементов. Реальное практическое внедрение масс-спектрометрии в аналитическую практику началось с 1960 г. На данный момент масс-спектрометрия является одним из основных методов получения информации о массах ядер и атомов. По соотношению масcизотопов материнского и дочернего излучений (U – Pb, K – Ar, Rb – Sr) определяют возраст горных пород, геологических, археологических и других объектов. Метод широко применяется для элементного анализа твердых неорганических веществ и материалов.

Масс-спектрометрические методы анализа • • Важным аспектом аналитической масс-спектрометрии является молекулярный анализ неорганических газов. С помощью масс-спектрометрии измерен ионный состав верхних слоев атмосферы Земли, Марса, Венеры. В медицине масс-спектрометрия применяется как экспрессный метод анализа респираторных газов. Аналитическую масс-спектрометрию отличают: - высокая чувствительность определения; - универсальность – возможность анализа широкого круга объектов от элементов до сложных белковых молекул с молекулярной массой до 105 г ∙ моль-1 ; - высокая специфичность и селективность. Масс-спектрометрию нередко сочетают с хроматографическими способами разделения, например, на основе газовой либо высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Масс-спектрометрические методы анализа • Задачи, решаемые масс-спектрометрией: - установление структуры органических соединений, включая определение молекулярной массы; - качественный и количественный анализ сложных смесей органических и неорганических соединений с высокой чувствительностью и разрешающей способностью; - определение изотопного состава; - исследование состава и структуры поверхностей. Масс-спектр представляет собой зависимость интенсивности сигнала детектора (относительной меры количества данного иона) от отношения массы иона к его заряду (m/z). Поэтому первым условием получения массспектра является ионизация анализируемых молекул. Разрешающая сила в масс-спектрометрии (R) определяется способностью различать две массы: (R) = m/Δm, где Δm – разница в массах двух компонентов, дающих разрешенные пики; m – номинальная масса, при которой появляется пик компонента. R =1000 означает отделение m/z = 1000/1001; 500/500, 5 и т. д.

Природа масс-спектра • • Для разделения ионов, отличающихся друг от друга хотя бы на одну единицу массы, достаточно их простого отклонения в сильном магнитном поле. При этом ионы с большей массой отклоняются меньше, чем ионы с меньшей массой: m/e = H 2 r 2/2 V, где H – напряженность магнитного поля, r – радиус круговой траектории движения, V – ускоряющее напряжение. В результате изменения Н при постоянных r и V можно направлять на детектор ионы Принцип действия электромагнитного с разной m/e. С другой стороны, масс-спектрометра при постоянном Н при изменении V можно регистрировать масс-спектр.

Природа масс-спектра • • • Масс-спектры регистрируются обычно в направлении от меньших масс к большим. Интенсивность основного пика произвольно устанавливается равной 100. Как правило, основной пик идентичен пику молекулярного иона. Термин «относительная молярная масса» химического соединения показывает, как велика масса данного соединения в сравнении с 1/12 массы Масс-спектр метилбензоата 12 С.

Природа масс-спектра • • Поскольку химические элементы состоят из смеси изотопов, то наряду с молекулярным пиком и пиками фрагментируемых ионов постоянно обнаруживается один либо несколько изотопных пиков. Соотношения интенсивностей такой группы пиков соответствует природной распространенности отдельных изотопов в данной комбинации атомов. Определение изотопного состава по масс-спектру вполне пригодно для получения брутто-формулы соединения. Из-за относительно большой доли тяжелых изотопов у таких элементов, как S, CI, Br, соединения, содержащие эти элементы, особенно хорошо поддаются идентификации. До сего времени существует несколько достаточно простых и удобных для общего употребления правил интерпретации спектров. Однако, не все так однозначно. Первичные ионы могут иногда на своей траектории движения претерпеть значительные перегруппировки, выделяя имеющуюся у них избыточную энергию. В результате возникают структуры, слабо связанные с исходной молекулой. По этой причине получаемый масс-спектр способен стать источником опасной дезинформации.

Массы и относительная распространенность изотопов некоторых элементов

Относительное содержание и точные массы наиболее распространенных элементов

Устройство масс-спектрометра • • • Масс-спектрометры относятся к весьма сложным аналитическим приборам. Цена одного массспектрометра значительно превышает 100 000 €. Главными узлами прибора являются система напуска, источник ионизации с ускорителем ионов, масс-анализатор (устройство для разделения ионов) и детектор в сочетании с регистрирующим устройством. Анализ проводят в вакууме: 10 -3 – 10 -4 Па (ионизатор), 10 -3 – 10 -8 Па (масс-анализатор).

Устройство масс-спектрометра • • • Система напуска. Количество вводимой пробы не должно превышать нескольких микромолей, чтобы не нарушить вакуум внутри прибора. Существуют прямой и непрямой способы ввода пробы. Прямой ввод пробы используют когда проба труднолетуча. Образец непосредственно вводят в ионизатор через систему шлюзовых камер. Для анализа достаточно нескольких нанограммов образца. При непрямом способе пробу вводят в масс-спектрометр в газообразном состоянии. Жидкий или твердый образец переводят в пар путем нагревания до 500 0 С в условиях вакуума (≈10 -4 Па). Еще один способ введения пробы состоит в том, что анализируемое вещество поступает в масс-спектрометр в ходе хроматографического разделения. Этот метод анализа называется хромато-масс-спектрометрия. Источники ионизации. Перед разделением анализируемые вещества необходимо перевести из нейтральных молекул или атомов в ионное состояние. На выходе из ионизатора проба находится главным образом в форме положительно заряженных ионов.

Способы ионизации в масс-спектрометрии • Несмотря на развитие альтернативных способов ионизации, классическая ионизация электронным ударом до сих пор остается важнейшим способом получения ионов.

Способы ионизации в масс-спектрометрии

Сравнение методик ионизации

Ионизация электронным ударом • Источником высокоэнергетических электронов служит раскаленная вольфрамовая или рениевая проволока. Энергия образующихся электронов составляет около 70 э. В. В результате ион претерпевает фрагментацию. • • Обычно масс-спектрометр регистрирует лишь положительно заряженные ионы. Ионизация электронным ударом относится к жестким способам ионизации. Она особенно удобна для идентификации веществ, поскольку при этом возникает множество осколочных фрагментов, а масс-спектр богат пиками и однозначно характеризует молекулу, служит как бы ее «отпечатками пальцев» . Однако сложность спектров может быть слишком велика. Кроме того, может не наблюдаться молекулярный пик – важнейший источник информации о составе молекулы. •

Ионизация электронным ударом • • • В масс-спектре нитробензола присутствует пик молекулярного иона М+ с массой 123. Однако самый интенсивный пик с m/z = 77 соответствует фрагменту, образовавшемуся в результате отщепления нитрогруппы. В масс-спектрах интенсивность пиков обычно нормируют, принимая интенсивность базового пика за 100%. В спектре присутствуют пики с m/z более высокими, чем у исходной молекулы. Это пики изотопно замещенных молекул, например, Масс-спектр нитробензола (ионизация 13 С с m/z = 124. электронным ударом)

Химическая ионизация • • Более мягкий способ ионизации основан на взаимодействии молекул пробы с ионами газа-реагента. Этот способ называется химической ионизацией. По степени распространенности он занимает второе место. Газ-реагент (метан, изобутан, аммиак) вводят в камеру для электронноударной ионизации при определенном давлении (от 1 до 10 мм рт. ст. ) с тем, чтобы он вступил во взаимодействие с молекулами аналита за счет переноса протонов или гидрид-ионов. Процесс химической ионизации начинается с ионизации газа-реагента. Например, в случае метана электронный удар приводит к образованию ионов СН 4+ и , СН 3+ которые затем реагируют с СН 4 с образованием СН 5+ и С 2 Н 5+: СН 4+ + СН 4 → СН 5+ + СН 3+ + СН 4 → С 2 Н 5+ + Н 2 Эти ионы реагируют с молекулами образца с переносом протона Н+, или гидрид-иона Н-, или электрона, что увеличивает заряд молекулы на единицу: СН 5+ + МН → МН 2+ + СН 4 С 2 Н 5+ + МН → МН+ + С 2 Н 6

Сравнение масс-спектров глюкозы, полученных методом электронного удара (слева) и химической ионизации (справа; газ-реагент – аммиак) • • • При электронном ударе наблюдается очень сильная фрагментация. Максимальное значение М равно 112 (пик С 8 Н 16+). Базовый пик находится при М=73. При химической ионизации спектр очень беден пиками. Самый интенсивный пик (М=198) является квазимолекулярным. Он возник в результате присоединения иона NH 4+ молекуле глюкозы. Истинный молекулярный пик находится при М=180.

Характеристики источников химической ионизации

Методы ионизации в масс-спектрометрии • • Полевая ионизация. В этом методе ионизация происходит под действием электростатического поля высокой напряженности (107 – 108 B/см). При этом наблюдается отрыв электрона от молекулы пробы вследствие квантовомеханического туннельного эффекта. Ионизация происходит на так называемом эмиттере, которым служит вольфрамовая проволока, покрытая пиролитическим углеродом. Полевая ионизация относится к мягким способам ионизации. Десорбционные методы ионизации. Незаменимы при исследовании биоорганических веществ с молярными массами порядка 10 000. Ионизации подвергается непосредственно твердая или жидкая фаза без ее предварительного испарения. Масс-спектры крайне просты и в предельном случае состоят только из молекулярного пика. В настоящее время для ионизации все шире используют лазеры, например, УФ-лазер с длиной волны 337 нм. Полевая десорбция. Пробу ионизируют на эмиттере под действием высокого напряжения. Масс-спектр в этом случае еще проще, чем при полевой ионизации.

Сравнение масс-спектров глюкозы, полученных методом полевой ионизации (слева) и полевой десорбции (справа)

Методы ионизации в масс-спектрометрии • • Бомбардировка быстрыми атомами. В этом методе для ионизации используют высокоэнергетические нейтральные атомы, например, Xe или Ar. Пробу, находящуюся в конденсированном агрегатном состоянии, помещают а ионизатор непосредственно или в виде раствора, например, в глицине. Метод бомбардировки быстрыми атомами применим для исследования высокомолекулярных (молярная масса до 10 000) и термически неустойчивых соединений. Масс-спектрометрия на основе ионно-молекулярных реакций. Этот способ может быть рекомендован для проведения анализов сложных газовых смесей. При этом используется вариант химической ионизации при низких давлениях < 10 -4 мбар. В основном применяют ксенон или криптон, подвергаемые ионизации посредством электронного удара: Xe+ + M → Xe + M +

Масс-спектрометры (масс-анализаторы) • • • Масс-спектрометры, принцип работы которых основан на действии магнитного поля, представлены в разных вариантах. Квадрупольный масс-спектрометр. Ионы образуются в результате электронного удара либо путем химической ионизации и разделяются в системе, состоящей из четырех немагнитных стержней. Между этими стержнями создается электрическое поле высокой частоты. Под действием Принцип действия квадрупольного поля ионы совершают колебательное масс-спектрометра движение, амплитуда которого возрастает по мере уменьшения массы. Т. о. , при изменении электрического поля достигается разделение и детектирование ионов с разными массами.

Квадрупольный масс-спектрометр • Недостатком квадрупольных масс-спектрометров является почти в 10 раз меньше чувствительность обнаружения по сравнению с магнитными массспектрометрами. Эти приборы достигают разрешения по массам до 4000. Блок-схема квадрупольного масс-спектрометра

Квадрупольный масс-спектрометр • Наиболее часто используют в варианте ГХ-МС. Можно получить 8 и более масс -спектров за секунду в диапазоне до 800 массовых единиц. Разрешение до 1500 (ГХ – обычно обеспечивает единичное разрешение). Квадрупольный ГХ-МС масс-спектрометр

Квадрупольный масс-спектрометр • Более распространен способ (TSP). Перегретый элюат из капилляра в виде струи пара и капель аэрозоля подается в вакуумную камеру, где ускоряется до звуковой скорости. При этом капли теряют молекулы растворителя. Термораспыление как способ сочетания с ЖХ

Квадрупольный масс-спектрометр • • Одной из разновидностей квадрупольного масс-спектрометра является ионная ловушка. Ее особенностью является совмещение области ионизации и анализа. После ионизации электронным ударом ионы удерживаются в электронной ловушке полем квадруполя. При увеличении U ионы покидают область удерживания в порядке увеличения m/z и достигают детектора.

Магнитный масс-спектрометр • • Для разделения ионов, отличающихся друг от друга хотя бы на одну единицу массы, достаточно их простого отклонения в сильном магнитном поле. При этом ионы с большей массой отклоняются меньше, чем ионы с меньшей массой: m/e = H 2 r 2/2 V, где H – напряженность магнитного поля, r – радиус круговой траектории движения, V – ускоряющее напряжение. В результате изменения Н при постоянных r и V можно направлять на детектор ионы Принцип действия электромагнитного с разной m/e. С другой стороны, масс-спектрометра при постоянном Н при изменении V можно регистрировать масс-спектр.

Магнитный масс-спектрометр • • Применение магнитного масс-спектрометра с высокой разрешающей способностью позволяет определять элементный состав веществ. Это достигается на основе точного измерения масс, поскольку атомный вес отдельных нуклидов в совсем незначительной, но все же различимой степени отличается от целочисленных значений. Огромное преимущество магнитного масс-спектрометра с высокой Примеры молекул или их фрагментов разрешающей способностью состоит с массовым числом 28 из дополнительной информации касательно элементарного состояния иона.

Время-пролетный ГХ-МС масс-спектрометр • Ионы проходят через пластины ускорителя с напряжением 3000 В с частотой импульсов от 3000 до 20 000 в секунду. • Кинетическая энергия ионов выражается как: mv 2/2 = Vq, где m – масса иона; v - скорость; V - напряжение ускорителя; q - заряд иона. Или v = √ 2 Vq/m. • Разность во времени достижения детектора для двух ионов (Δt) составляет (L –длина пролетной трубки) Время-пролетный масс-анализатор

Время-пролетный масс-спектрометр • Время-пролетные мас-спектрометры (Time-of flight-spectrometer) способны перекрывать абсолютно неограниченную область массовых чисел. Можно обнаружить все элементы периодической системы, более или менее крупные молекулы и ионные комплексы при разрешении M/ΔM = 2000. Принцип действия время-пролетного масс-спектрометра

Масс-спектрометр X Series 2 • • • Производитель: Thermo Scientific Corp. (USA). Год выпуска: 2007. Технические характеристики: эмиссионный спектрометр – Ocean Optics HR 2000; оптический диапазон 260 - 980 нм; оптическое разрешение 0, 1 нм; детектор - линейная ПЗС матрица на 2048 элементов из кремния; система лазерной абляции UP – 213, размер пятна 50 - 300 мкм, разрешение - 0, 25 мкм; диапазон регистрируемых масс от 4 до 250 а. е. м.

Сдвоенный (тандемный) масс-спектрометр • • • В технике сдвоенной масс-спектрометрии последовательно соединяются два масс-спектрометра, в первом из которых осуществляется разделение смеси на молекулярные ионы, а во втором - диссоциация в результате активации столкновениями с нейтральным газом. В так называемой тройной (triple-stage) квадрупольной масс-спектрометрии в первом квадруполе отфильтровывается одна масса, во втором – инициируется столкновение, в третьем регистрируется так называемый дочерний спектр (daughter scan). Первый квадруполь сканирует исходный ( «материнский» ) спектр (parent scan) в определенной области массовых чисел, причем ионы разных масс последовательно попадают в столкновительную камеру второго квадруполя и подвергаются там фрагментации. Третий квадруполь устанавливается на некоторую постоянную массу, специфичную для определенного класса веществ. Еще один возможный вариант настройки действует по принципу «neutral loss scan» , когда два квадруполя, первый и последний, настроены на постоянную разность мас.

Принцип тандемной масс-спектрометрии

Хромато-масс-спектрометр: жидкостной хроматограф Agilent 1200 c массселективным детектором на основе трех квадруполей 6410 • • • Производитель: Agilent Technologies (USA). Год выпуска: 2007. Технические характеристики: режимы электрораспыления и химической ионизации; диапазон масс 15 -1650 а. е. м. , погрешность 0, 2 а. е. м. ; скорость сканирования более 5200 а. е. м. /с; чувствительность (сигнал: шум) для 0, 5 пкг резерпина 20: 1; диапазон длин волн от 190 до 950 нм с шагом 1 нм диапазон р. Н 1, 0 - 12, 5; автосамплер для автоматического ввода 384 образцов; скорость регистрации спектра по всему диапазону не более 12, 5 миллисекунд.

Применение масс-спектрометрии • • • Определение молекулярной массы. Источником информации служит положение молекулярного пика М+ или его производных – пиков (М + 1)+, (М - 1)+, а также квазимолекулярных пиков. Установление брутто-формулы вещества. При наличии масс-спектрометров высокого разрешения (с двойной фокусировкой) брутто-формулы соединения можно установить непосредственно. Предположим, что в масс-спектре для молекулярного пика вещества найдено массовое число, равное 120, 070± 0, 005. Расчеты показывают, что это может быть бензамин C 7 H 8 N 2 (М=120, 069), но не ацетофенон C 8 H 8 О (М=120, 096). Для установления брутто-формул существуют специальные таблицы с точными значениями молярных масс всех возможных соединений, состоящих из атомов C, H, N, O. Важным правилом является так называемое «азотное число» . Оно гласит, что если молярная масса вещества (округленная до целого) нечетна, то его молекула содержит нечетное число атомов азота. Наличие изотопов приводит к появлению пиков М+, (М + 1)+, (М + 2)+ и т. д.

Установление брутто-формулы вещества • • Рассмотрим в качестве примера изотопные пики метана и этана. В соответствии с содержанием отдельных изотопов отношение интенсивностей пиков 12 СН 4 и 13 СН составляет 100: 1, 1. 4 Для этана возможны следующие изотопно замещенные молекулы:

Установление брутто-формулы вещества • • В общем случае при наличии двух изотопов одного элемента с молярными массами, различающимися на единицу, соотношения интенсивностей пиков М+, (М + 1)+, (М + 2)+ и т. д. являются слагаемыми биноминального разложения (a + b)n, где a – относительное содержание легкого изотопа; b - относительное Распределение интенсивностей содержание тяжелого изотопа; изотопных молекулярных пиков CI и Br n – число атомов данного элемента в молекуле. Для элементов S, Si, CI, Br массы природных изотопов различаются на 2 единицы. Например, для молекулы с двумя атомами CI (1 + 0, 324)2 = 1 + 2∙ 1∙ 0, 324 + 0, 3242 = 1 + 0, 648 + 0, 105.

Установление структуры с помощью осколочных спектров • Процесс ионизации молекулы длится около 10 -16 с. Время прохождения иона от источника ионизации до детектора составляет ≈ 10 -5 с. За это время может образоваться множество осколочных ионов-фрагментов. С одной стороны – это ионы, обладающие характерным значением массы. С другой – ионы, обладающие характерным значением разности между массой молекулярного пика и собственной массой. Такие ионы возникают в результате отщепления от исходного иона М+ определенной нейтральной частицы Х и имеют массу, равную М – Х. • Осколочные ионы часто группируются в периодические серии. Их наличие обусловлено последовательным отщеплением одного и того же структурного фрагмента. Так, для насыщенных алифатических углеводородов наблюдаются «алкильные серии» вследствие последовательного отщепления фрагмента СН 2 (m/z = 14).

Важнейшие осколочные ионы с характерным значением масс

Важнейшие осколочные ионы с характерными значениями разностей масс

Масс-спектр н-додекана, демонстрирующий серийный характер расположения осколочных пиков вследствие отщепления фрагментов Сn. H+2 n+1

Качественный анализ • • • При идентификации веществ с помощью масс-спектрометрии исходят из того, что характер фрагментации неизвестного вещества и соединения предполагаемой структуры одинаковый, а спектры получены в близких экспериментальных условиях. В любом случае при использовании способа ионизации с сильной фрагментацией (например, электронного удара) вероятность совпадения массспектров одного и того же вещества выше, чем масс-спектров разных веществ. Для надежной идентификации необходимо наряду со спектром неизвестного вещества экспериментально получить и масс-спектр вещества с предполагаемой структурой. Существующие библиотеки масс-спектров насчитывают до 150 000 спектров различных соединений. Имеются и специализированные библиотеки для отдельных классов веществ – пестицидов, лекарственных средств.

Количественный анализ • • Для количественного анализа можно использовать масс-спектр как таковой. Для этого следует выбрать некоторый пик, принадлежащий определяемому компоненту, и измерить его интенсивность. Для исключения влияний условий эксперимента используют внутренний стандарт – обычно изотопную разновидность определяемого вещества или его гомолог. Анализ органических веществ.

Количественный анализ • • Количественное определение и идентификация смесей органических соединений часто ограничены сложностью получаемого масс-спектра. Поэтому перед масс-спектрометрической детекцией желательно разделять компоненты. С этой целью используют сочетания масс-спектрометрии с различными видами хроматографии и капиллярного зонного электрофореза. Для построения масс-хроматограммы берут интенсивность пиков нескольких ионов из каждого записанного масс-спектра и строят график зависимости этих интенсивностей от номера масс-спектра, соответствующего времени удерживания того или иного компонента. Преимуществами хромато-масс-спектрометрического метода являются высокая селективность и низкие пределы обнаружения (до 10 -12 - 10 -10 г. ). В некоторых случаях хромато-масс-спектрометрия является единственно возможным методом определения. Это относится к группе особо опасных токсикантов: полихлорированных дибензо-n-диоксинов (ПХДД) и дибензофуранов. Так, существует 22 изомерных тетрахлорпроизводных ПХДД, из которых нужно уметь определить лишь одно соединение.

Хромато-масс-спектрометрический спектр речной воды

Количественный элементный анализ • Элементный анализ осуществляют путем ионизации образца в электрической искре (твердые образцы, одновременно до 60 -70 элементов, 10 -12 г. ), ИСП или тлеющем разряде. В настоящее время масс-спектрометрия с ИСП стала очень важным методом анализа растворов, позволяющим определять любые элементы ( с массовыми числами начиная от 3) с пределами обнаружения от 0, 1 до 10 ppm. В ион-ионной масс-спектрометрии LOD достигает 10 -18 г.