Марат Оспанов атындағы Батыс Қазақстан Мемлекеттік Медициналық Университеті Факультеті: Жалпы медицина Кафедрасы: Иммунология Студенттің өзіндік жұмысы Тақырыбы: Моноклонды антиденелер. Гибридомды технология. Моноклонды антиденелердің қолданылуы. Орындаған: Әмзеев А. 315 А Қабылдаған: Урекешов Б. С.
Жоспары: 1. 2. 3. 4. 5. Антидене дегеніміз не? Моноклоналды антидене Моноклонды антиденелерді алу Моноклонды антиденелердің қолданылуы Гибридомды технологиямен танысу
1. Антидене дегеніміз – иммуноглобулин класына жататын, антиген организмге парентеральды түскеннен кейін синтезделетін белок. Антидененің антигенмен байланысатын арнайылық қасиеті бар. Антиденелер лимфоидты органдар клеткаларымен синтезделеді. Ол қанда және организмнің басқа сұйықтықтарында циркуляция жасап жүреді. Кез келген антидене өзінің антигенін ғана таниды, нақтырақ айтсақ антигеннің бір ғана детерминанттық тобымен байланысады. Детерминанттық топ белокқа тән кеңістіктік құрылымы бар бірнеше аминқышқылдарынан тұрады. Антиденелер қанға түскен бкатерия, вирустардың токсиндерін, жылан уын нейрализациялау үшін қолданады.
2. Ғылыми зерттеулерде және медициналық практикада антидене қолдану аймағы кеңеюде. Антиденені қарапайым әдіспен жануарларды егу арқылы алу жолында біртекті антидене алынбайды, өйткені иммунизацияланған жануарлар қанында әртүрлі арнайы кең спектрлі антиденелер болады, ал қосымша еккенде иммуноглобулиндердің әртүрлі класына жататын антиденелер синтезделеді. Бұл жағдайдың шешілуі – қажетті арнайы антидене түзетін жасуша клондарын бөлуі мен дақылдандыруы болып көрінді. Өткен ғасырдын 50 -ші жылдарындағы иммунохимиктер иммуноглобулин құрылысын зерттегенде моноклонды антидене қолдана бастаған, яғни олар лимфойдты ісік жасушаларының – миеломаның өнімдері. Миелома – ол сүйек кемегі жасушасынан дамитын ісік. Ол антидене түзетін шектеусіз көбейетін лимфоидты жасушалар клондары болып табылады.
3. Моноклонды антидене алудың мақсаты – берілген арнайы антиденелерді түзетін шектеусіз көбеюші жасушалар клондарын алу болды. Бұл мақсатта 1975 жылы Г. Киллермен Ц. Мильштейн қалыпты лимфоциттер мен миелоидты жасушаларды қоректі орталарда қосып, гибрид алған. Гибридома алу бірнеше кезеңнен тұрады: миелоидты линиясын алу; көкбауыр жасушаларын организмнен алу; дақыл алу үшін екі жасушаларды бірбірімен қосу; жасушалар қосылғаннан кейін, клондарды алу. Осы кезендерді азоттық сұлықта консервациялап, дайындайды. Миелоидты жасушаларды тышқандардан алады.
Гибридомаларды алу әдістің негізінде көкбауырдың сенсибилизденген лимфоциттердің және миеломды жасушалардың қосылуынан кейін гибридтік жасұшалардың сериялық өсіруі жатыр. Кейіннен керекті ерекшелігі бар антиденелерді секреттейтін клондарды іріктейді. Іріктелген клонды жасұшалардың дақылдары ретінде сақтайды немесе тышқандардың ағзасында асцидтік ісік ретінде сақтайды. Гибридомды технология бір неше кезеңдерден тұрады: дайындық жұмыстар, моноклондарды алу, клондарды сақтау, реклондау, асцидтік ісік алу, антиденелерді тесттілеу, антиденелерді тазалау. Иммунизацияға алдын ала тазаланған антигенмен қолданады. Тышқандардың қарнына минерал майын немесе инертті қатты пластикті енгізіп жануарлардың ағзасында ісік жаратылуға жол береді. Миелома жаратылуға жануардың генетикалық қасиеттері өте маңызды болады. Инбредтік тышқандардың тек қана екі түрінен осы ісіктерді алуға мүмкіншілік туды. Антигенді 3 -5 рет 0, 5 -5 мг мөлшерде енгізеді. Бірінші иньекцияны Фрейнд адьювантымен жануарға 0, 5 мл мөлшерде салады. Ақырғы иммунизациядан 2 -4 күн өткеннен кейін тышқандарды өлтіріп, көкбауырдың жасұшаларының суспензиясын дайындайды: көкбауырды зарарсыздандырылған жағдайда шығарып алып, оны хирургиялық пинцеттің көмегімен немесе сүзгіштен өткізіп бұзып суспензия жасайды. Суспензия көлемін 10 мл дейін Эрл ортасымен немесе тұзды буфермен жеткізеді.
Иммунизацияға алдын ала тазаланған антигенмен қолданады. Тышқандардың қарынына минерал майын немесе инертті қатты пластикті енгізіп жануарлардың ағзасында ісік жаратылуға жол береді. Миелома жаратылуға жануардың генетикалық қасиеттері өте маңызды болады. Инбредтік тышқандардың тек қана екі түрінен осы ісіктерді алуға мүмкіншілік туды. Антигенді 3 -5 рет 0, 5 -5 мг мөлшерде енгізеді. Бірінші иньекцияны Фрейнд адьювантымен жануарға 0, 5 мл мөлшерде салады. Ақырғы иммунизациядан 2 -4 күн өткеннен кейін тышқандарды өлтіріп, көкбауырдың жасушаларының суспензиясын дайындайды: көкбауырды зарарсыздандырылған жағдайда шығарып алып, оны хирургиялық пинцеттің көмегімен немесе сүзгіштен өткізіп бұзып суспензия жасайды. Суспензия көлемін 10 мл дейін Эрл ортасымен немесе тұзды буфермен жеткізеді. Суспензияны 170 об/мин 15 минут центрифугадан өткізеді. Микроскоп астында алынған суспензияның жасушаларының өмірге кабілеттігін анықтайды. Анықтау жұмысын өткізгенде үлгілерді көк трипанның 0, 1 пайыздық ерітіндісімен бояйды. Көкбауырдың жасушаларының суспензиясын гибридизациялық қосылуға дайындайды. Ол үшін алдын ала қосылудың алдында бір тәулік бұрын 24 -ұялық полистиролды платаның ұяларына 400 мкл қоректік жасушаларды салады. Қоректік жасушалар ретінде тышқандардың немесе теңіз шошқалардың макрофагтарын алады.
Қосылуды келесі түрде өткізеді: центрифугалық сынауықта 1 мл-де 75 пайызы өмірге жарамды қасиеті бар 108 көк бауырдың жасушаларын және 107 миеломды жасушаларды араластырады: 5 мл Дульбекко модификациялаған Игла ортасымен (МДСИ) жуады және 5 минут 100 об/мин центрифугадан өткізеді; тұнбаны 50 мл ыдысқа құяды. Кейіннен тұнбаға абайлап тамшымен 0, 5 мл 50 пайызды ПЭГ 4000 ерітіндісін қосады, ыдысты 1 сағат аралығында сілкіп қойып суспензиялайды. Кейіннен қоспаға (суспензияға) тамшымен 10 мл МДСИ қосады; 10 минуттан кейін көлемді ГАТ ортасымен (құрамында гипоксантин, амидоптерин, тимин кешені) 50 мл-ге дейін жеткізеді. Алынған суспензияны 1 мл-ден 24 ұялы платаға құйып 37 градуста 5 пайызды көмірқышқыл газы бар көмірқышқылды инкубаторда ұстайды; әр бір 4 күнде ортаны ауыстырып отырады. 2 – 4 жұма өткеннен кейін тірі қалған клондарды қоректік жасушалары бар 96 -ұялы платаға отыртады. Клондардың өмірге жарамдығын микроскоп астында анықтайды. Дақылды сұйықтықты жұма сайын радиоиммундық, иммунофлуоресценттік және иммуноферменттік әдістер арқылы тексеріп тышқан иммуноглобулиндерінің барын анықтайды.
Антигенмен байланысқан моноклоналды антидене
Гибридомаларды алу және моноклоналды антиденелерді бөліп алу кестесі: 1. Антиген еңгізу. 2. Көк бауырдың жасұшаларын алу (108). 3. Миеломды жасұшаларды алу (107). 4. ПЭГ 4000 ортасында жасұшаларды қосу. 5. ГАТ ортасында гибридомаларды іріктеу. 6. Клондарды бөліп алу. 7. Дақылды суйықтықты антиденелер болуына тексеру. 8. Пассаждарда реклондау. 9. Дақылды суйықтықтан моноклоналды антиденелерді бөліп алу. 10. Клонды -70 градуста сақтау. 11. Асциттік ісік алу.
Клеткаға шабуыл жасаған моноклоналды антиденелер
Гибридомаларды алу және моноклоналды антиденелерді бөліп алу Тышқандардың ішіне бір неше рет көп уақыт минерал майларымен әсер етіп, олардың ағзаларында миелома тұдырып, жұмысқа жарамды миеломды жасұшаларды алады. Осы жасушаларды әдейленген зертханаларда да алады. Клондау жұмыстарын жалғастыру үшін ГАТ ортасына қоректік жасұшалар ретінде 500 мл ортаға 108 көкбауыр жасушаларын және 106 перитонеалды жасушаларды салады. Суспензияны 1 млден 96 -ұялы панельге құйып көмірқышқыл инкубаторда 37 градуста ұстайды. Әр бір үш тәүліктен кейін ортаны ауыстырып отырып, жасушалардын өмірге жарамдығын тексереді. Дақылды суйықтықта секреттейтін клон болса моноклоналды антиденелер жаратылады. Іріктеліп алынған гибридоманың клонын келесі микродақылдарда реклондайды. Дақылды суйықтықтың құрамында моноклоналды антиденелер болса, оларды эксперименттерде, иммунодиагностикумдарды дайындау үшін биотехнологиялық үдірістерде қолданады.
Асцидтік ісікті алу. Жануарлардан гибридомалар алу үшін, олардың қарындарының ішіне гибридтік жасушалар жаратылу мақсатымен 0, 5 мл тристан (тетраметилпептадекан) немесе Фрейнд адьювантын және тұзды буфердегі керекті клонның жуылған 1 – 2 мл (1 мл – 10 жасұша) жасушаларын еңгізеді. Тышқанның ішінде ісік белгіленеді. Асцидтік суйықтықта моноклоналды антиденелерді анықтайды. Тышқанның қанының сары суында және асцидтік суйықтықта иммуноглобулиндердің көлемі 3 15 г/л, ал моноклоналды антиденелер – 50 мг/л. Бір тышқаннан 10 мл асцидтік суйықтықты алады. Асцидтік суйықтықты кейіннен тағын ісік алуға жіберуге болады (айына 1 рет) және серологиялық реакцияларда антигенді анықтағанда қолданады. Моноклоналды антиденелерді тесттілеу. Моноклоналды антиденелерді анықтау үшін сезімталды тест-жүйелермен қолданады: радиоиммунологиялық, иммунофлуоресценттік, иммуноферменттік. Моноклоналды антиденелерді тесттілеуге арналған тест-жүйелердің компоненттері – тышқанның антисары суы және антигенді препараттар. Олар көп болу керек, неге десек, әр бір 3 күнде әр бір ұяның құрамын моноклоналды антиденелерін барына зерттейді. Осындай тесттілеуді сканирование деп атайды. Бірінші сканирование қосылу өткеннен кейін он екінші күнде өткізіледі. Он реакция беретін гибридті жасушаларды пассажға ауыстырып, бір ұяда бір клон болғанша көлемін арттырады.
Клетка жанына шоғырланған моноклоналды антидене
Антиденлерді тазалау. Алынған дақылдың және асцидтік суйықтықтың құрамында моноклоналды антиденелерден басқа компоненттер болады. Оларды жою керек. Иммуноглобулин М бөліп алғанда дақылды суйықтықтың 100 мл 28 гр аммоний сульфатын салады (45 пайыздық ерітінді). Қоспаны 12 сағат 4 градуста сақтайды, 20 минут 10000 об/мин центрифугаттайды. Тұнбаны 45 пайызды аммоний сульфатымен жуады, 10 мл 0, 05 М тристан буферінде орнына келтіреді, сефароза бар хроматографиялық колонкасынан өткізеді, 0, 1 М альфаметилгликозиді бар 0, 05 М трисбуфермен жуады. Моноклоналды антиденелердің кейінгі қолдануы олардың титрімен, аффиндігімен, ерекшелігімен байланысты. Афиндік – антидененің және антигенді детерминантаның қатнасу деңгейі. Моноклоналды антидененің титрі төмен, афиндігі әр түрлі болады. Иммунохимияда және аффинді хроматографияда төменаффинді моноклоналды антиденелермен қолдануға болады, бірақ ИФА сараптауға моноклоналды антидене жоғары аффинді болу керек. Диагностикалық мақсатымен моноклоналды антидененің бір неше клондарының кешендерін қолданады. Моноклоналды антиденелермен таза түрінде қолданбайды. Оларды ферменттермен және радиоизотоптармен таңбалап ИФА және РИА сараптауда қолданады.
1984 ж ақпан айында Г. Келлер мен Ц. Мильтштейн “in vitro” моноклонды антиденелер алудың гибридомалық технологиясын ашқан үшін Нобель сыйлығына ие болған. Қазіргі кезде моноклонды антиденелерді дүние жүзіндегі фармацевтикалық өндірістерінде шығарады, өйткені олар иммунологиялық зерттеулерде маңызды рөл атқарады. Оларды ерекше фенотиптік маркерлері бар жасушаларды іріктеуде; әр жасушалар бетіндегі молекулалардың қызметін анықтауда; антигендердін күрделі қоспаларын талдауда; әр даму кезеңдегі сонымен қатар эмбриогенездегі жасушалардың антигенді құрамын талдауда пайдаланылады. Клиникада моноклонды антиденелер адамның иммундық статусын бағалауда, лимфоциттердің субпопуляциясын іріктеуде кең қолданылады. Қазіргі кезде моноклонды антиденелер гендік инженерияда, зерттеу, диагностикалау, емдеу мақсаттарымен кең пайдаланылуда.
2. 3. Пайдаланылған әдебиеттер: 1. Шортанбаев Ә. Ә. , Қожанова С. В. “Жалпы иммунология” Алматы 2008 Кеннет Р. Г. , Мак-Керн Т. Дж. , Бехтол К. Б. Моноклональные антитела: Гибридомы: новый уровень биологического анализа. М. : Медицина, 1983. Ройт А. Основы иммунологии. М. : Мир, 1991.
Скачать презентацию Марат Оспанов атындағы Батыс Қазақстан Мемлекеттік Медициналық Университеті
Иммунология монок.ы антиденелер срс 1.ppt