Люминесценция биологических систем
Люминесценция представляет собой избыточное над тепловым излучение тела при данной температуре, имеющее длительность много большую, чем период излучаемых световых волн (>>10 -15 с). Первая часть определения отделяет люминесценцию от теплового равновесного излучения и показывает, что люминесцировать тело может при любой температуре. (Поэтому люминесценция часто называется холодным свечением). Вторая часть определения (признак длительности) была введена С. И. Вавиловым, чтобы отделить люминесценцию от различных видов рассеяния света, отражения света и др. Отличие в том, что при люминесценции между поглощением и испусканием происходят промежуточные процессы, длительность которых больше периода световой волны. ВАВИ ЛОВ Сергей Иванович (1891 - 1951) российский физик, государственный и общественный деятель, один из основателей российской научной школы физической оптики и основоположник исследований люминесценции и нелинейной оптики в СССР. Президент АН СССР (1945 -1951).
Начальным актом люминесценции является возбуждение атомов и молекул вещества (переход из основного невозбужденного в одно из возбужденных состояний). В зависимости от способа возбуждения различают различные виды люминесценции: v фотолюминесценция – под действием потока фотонов, v ионолюминесценция – потока ионов, v катодолюминесценция – потока электронов (катодных лучей), электролюминесценция – при возбуждении электрическим разрядом, рентгенолюминесценция – под действием рентгеновского излучения, хемилюминесценция – сопровождает химические реакции и т. д. Классификация люминесценции по длительности свечения: флюоресценция – кратковременное ″послесвечение″ (через 10 -7 -10 -8 с после возбуждения); фосфоресценцию – длительное ″послесвечение″ (время свечения может составлять от 10 -3 с до многих секунд и даже минут).
На каждом заполненном уровне могут находиться два электрона с противоположными спинами, обозначаемыми стрелками в соответствующих квадратах. Основной уровень S 0, а также возбужденные уровни S 1, S 2…. . называются синглетными. При переходе между синглетными уровнями спин электрона не меняет направление. Если же происходит изменение спина электрона на противоположный, то атомная система переходит в возбужденное триплетное состояние T 1, в котором спины электронов одинаковы. Фосфоресценция - переход из триплетного состояния T 1 в основное состояние S 0 запрещен квантовыми правилами отбора (имеет малую вероятность), поэтому на уровне T 1 молекулы находятся значительно дольше (104 с-10 с). Флуоресценции соответствует переход S 1→S 0, т. к. время жизни биомолекул в возбужденном синглетном состоянии S 1 составляет 10 -9 -10 -8 с. Фосфоресценция происходит при переходе T 1 →S 0, и вещество при этом продолжает светиться даже после прекращения возбуждения его молекул.
Триплетный уровень T 1 имеет меньшую энергию, чем синглетный уровень S 1, следовательно, энергия фотона, испускаемого при фосфоресценции, меньше энергии фотона, испускаемого при флуоресценции (или длина волны фотона при фосфоресценции больше, чем при флуоресценции). Спектры поглощения и люминесценции для молекулы тирозина
Виды флуоресценции: Наиболее простой случай резонансной флуоресценции реализуется обычно в одноатомных газах. В этом случае энергия излученного фотона hv’ равна энергии поглощенного при возбуждении фотона hv. резонансная флюоресценция В более сложных веществах велика вероятность других процессов. Избыточная энергия, приобретаемая молекулами при поглощении возбуждающих фотонов, перераспределяется внутри молекул так, что значительная ее часть переходит во внутреннюю энергию, что соответствует безизлучательному переходу E 3→E 2. В результате излученный при люминесценции фотон (переход E 2→E 1) имеет энергию, меньшую энергии поглощенного фотона.
Правило Стокса Длина волны излученного фотона не меньше длинны волны поглощенного при возбуждении фотона ( ). Это утверждение составляет содержание закона Стокса, справедливого, в основном, для люминесценции: спектр люминесценции сдвинут в сторону больших длин волн относительно спектра, вызвавшего эту люминесценцию. Свечение флуоресцеина в ультрафиолетовых лучах Свет люминесценции имеет иной спектральный состав, чем свет, вызывающий эту люминесценцию. В этом можно легко убедиться, если направить пучок фиолетового света на колбу с раствором флуоресцеина. Освещаемая жидкость, в соответствии с законом Стокса, начинает ярко светиться зелёно – жёлтым светом.
Возможны отклонения от закона Стокса – антистоксовое излучение. Оно наблюдается в том случае, если возбуждаются молекулы, находящиеся уже в возбужденном состоянии (переход E 2→E 3 ). Излученный затем при переходе E 3→E 1 фотон будет иметь бо′льшую энергию (и меньшую длину волны), чем таковые для поглощенного фотона. Спектр антистоксового излучения смещен в сторону меньших длин волн относительно возбуждающего спектра.
Квантовым выходом люминесценции (φ) называется отношение числа фотонов, излученных при люминесценции (Nизл) к числу поглощенных фотонов (Nпогл): Квантовый выход люминесценции зависит от природы вещества, его состояния, температуры, наличия примесей в его составе. В жидких растворах молекулы люминесцирующего вещества многократно сталкиваются с молекулами растворителя и безизлучательно теряют энергию – происходит тушение люминесценции. При охлаждении и замораживании раствора интенсивность люминесценции значительно усиливается. Закона Вавилова: квантовый выход люминесценции не зависит от длины волны возбуждающего света. Люминесценция наблюдается, в основном, при переходе электронов с первого возбужденного уровня на основной невозбужденный уровень, и интенсивность люминесценции не зависит от того, на какой из верхних энергетических уровней был совершен переход при возбуждении молекул. В любом случае часть поглощенной энергии переходит в теплоту, а при люминесценции высвечивается фотон с энергией, равной разности энергий первого возбужденного и основного состояний.
Возможно добавление к нелюминесцирующим веществам специальных флуоресцирующих молекул – флуоресцентных зондов и меток, которые связываются с мембранами, соответственно, нековалентно и химически. Параметры флуоресценции таких молекул очень чувствительны к структуре их окружения. Таким образом, по люминесценции можно изучать межмолекулярные взаимодействия, конформационные и химические превращения. Гибридизация с флуоресцентной меткой (FISH) В методе FISH используются флуоресцирующие молекулы для прижизненной окраски генов или хромосом. Метод используется для картирования генов и идентификации хромосомных аберраций.
Люминесцентный анализ - определение природы и состава вещества по его спектру люминесценции. Высокая чувствительность 1. Вещества с φ ≥ 1% метода 2. Примесь до 10 -10 г люминофора Диагностика заболеваний: под УФ флюоресцируют многие ткани (хрусталик и роговица глаза, ногти, зубы и др. ) Определение времени циркуляции крови и области с пониженным кровоснабжением. ↑ Интенсивности свечения сыворотки крови при воспалении легких. Определение начальных стадий порчи продуктов. Определение углеводородов в воздухе Кожные заболевания: характерное свечение имеют бактерии и грибковые колонии. обнаруживаются по характерному свечению Определение проницаемости капилляров кожи При стрессах ↑ интенсивность свечения плазмы крови Сортировка фармакологических препаратов. Голубая флуоресценция обусловлена наличием в напитке производных хинина.
Специальные флуоросцирующие материалы, добавляемые к нелюминесцирующим веществам и связываемые с мембранами Флуоросцирующие зонды (нековалентная связь) Флуоросцирующие метки (химическая связь) Параметры флуоросценции зондов и меток чувствительны к структуре окружения Возможность излучения межмолекулярных взаимодействий, конформационных и химических превращений и т. д. Детекция хромосомной перестройки методом флуоресцентной in situ гибридизации хромосомных пэйнтинг проб с метафазными хромосомами пациента. Зеленый сигнал - материал хромосомы 5, красный сигнал - матерал хромосомы 20. Общее окрашивание хромосом красителем DAPI (синий сигнал).
Блуждающие квантовые точки высвечивают диагноз. Флуоресцентные квантовые точки – полупроводниковые кристаллы нанометрового размера (например, селенид кадмия), обладающие уникальными физическими и химическими свойствами, не характерными для тех же веществ в макромасштабе. Они могут поглощать и излучать свет, благодаря чему их используют в качестве флуоресцентных меток. Так выглядит скопление разных квантовых точек, облучаемых лазером Нанокристалл селенида кадмия диаметром всего в пятнадцать атомов
Растворы квантовых точек выглядят, как подкрашенная водичка С помощью оптического микроскопа мы не можем проследить за перемещением отдельных молекул внутри живой клетки, а с помощью электронного микроскопа отдельные молекулы видно, но для этого клетку приходится умертвить. Однако если снабдить квантовые точки специальными маркерами, то можно прикрепить эти наносистемы к отдельным типам молекул. Для клетки это не представляет вреда, и, что самое главное, результаты видны в оптический микроскоп, благодаря флуоресценции маркеров. Поэтому исследователи используют квантовые точки в биологических исследованиях. Применение квантовых точек в качестве люминесцирующих маркеров значительно расширяет диагностические возможности в медицине. Создавая множество разновидностей квантовых точек и соединяя их с различными биомолекулами или антигенами, можно обнаруживать внутри организма участки с различными сочетаниями Полупроводниковые квантовые точки признаков патологий. (зелёный цвет) в клетках мыши
Люминесцентная микроскопия метод наблюдения под микроскопом люминесцентного свечения микрообъектов при освещении их сине-фиолетовым светом или ультрафиолетовыми лучами. Цвет люминесценции смещен в более длинноволновую часть спектра по сравнению с возбуждающим ее светом (правило Стокса). При возбуждении люминесценции синим светом цвет ее может быть от зеленого до красного, если люминесценция возбуждается ультрафиолетовым излучением, то свечение может быть в любой части видимого спектра. Эта особенность люминесценции позволяет, используя специальные светофильтры, поглощающие возбуждающий свет, наблюдать сравнительно слабое люминесцентное свечение. Микроскоп Люминесцентные микроскопы — обычные бинокулярный микроскопы, которые люминесцентный снабжены источником Микмед-2 ультрафиолетового света и набором светофильтров. Свет от источника (ртутная лампа сверхвысокого давления) проходит через два фильтра.
Первый (синий) фильтр (помещают перед источником света) - задерживает видимый свет перед образцом и пропускает свет, возбуждающей люминесценцию либо самого объекта (собственная люминесценция), либо специальных красителей, введённых в препарат и поглощённых его частицами (вторичная люминесценция). Второй (жёлтый) фильтр (помещают перед окуляром микроскопа) задерживает синий свет, но пропускает жёлтый, красный, зелёный свет, излучаемый флюоресцирующим объектом и воспринимаемый глазом. Приготовление препарата для люминесцентной микроскопии не сложно: па предметном стекле каплю исследуемого материала смешивают с Схема освещения и каплей раствора флюорохрома и покрывают регистрации изображения при покровным стеклом. люминесцентной микроскопии В люминесцентной микроскопии используют освещение препаратов как сверху (через объектив, который в этом случае служит и конденсором), так и снизу, через обычный конденсор. Метод нашел широкое применение в микробиологии, вирусологии, гистологии, цитологии, в пищевой промышленности, при исследовании почв, в микрохимическом анализе, в дефектоскопии. Кроме того, информация о составе и свойствах исследуемых веществ, которую можно получить, зная интенсивность и спектральный состав их люминесцентного излучения, имеет огромную ценность.
Borrelia burgdorferi. Люминесцентная микроскопия. не вместилось на слайд № 16
Хемилюминесценция - люминисценция, сопровождающаяся химической реакцией НЕ поняла сокращен состояние за счет энергии, выделяющейся при химических реакциях: рекомбинации перекисных св. радикалов липидов RO 2 + RO 2→ возбужденный продукт → продукт + квант хемилюминесценции Виды спонтанной хемилюминесценции биолюминесценция Митогенетическое излучение – УФ излучение 190 - 320 нм (субстратом служат белки и углеводы) стимулирует клеточное деление сверхслабое свечение воспринимаемое глазом свечение 420 -710 нм присуще многим организмам : светлячкам, рыбам, грибам, бактериям… излучение животных организмов, тканей, клеток, некоторых биосубстратов в видимом и ИК – облучении. 360 -800 нм Присуще многим реакциям в биологических объектах – окислительным реакциям экзотермического характера
В организме свободнорадикальное окисление, тормозится системой тканевых антиокислителей (аскорбиновая кислота, адреналин, сульфгидрильные соединения, каротиноиды, фосфолипиды). Развитие ценного и свободнорадикального окисления в тканях может быть патогенетической основой некоторых заболеваний. При этом сверхслабое свечение может служить диагностическим тестом. Интенсивность хемолюминесценции резко ↑ при добавлении к исследуемому раствору биологических частиц катализаторов ( ZB, соли двухвалентного железа Fe 2+ ) ZB при гнойном аппендиците или при холецистите вводить в плазму крови Fe 2+ , то интенсивность люминесценции ↑ (но при гнойном аппендиците значительно слабее, чем при Iл холецистите => по этому критерию можно с достоверностью до 90 % диффиренциально диагносцировать эти 2 заболевания. ↑Fe 2+ t
Фотобиология - раздел биофизики, изучающий закономерности и механизмы действия света на биологические системы разной сложности. Фотобиологическими называются процессы, начинающиеся с поглощения квантов света биологическими соединениями и заканчивающиеся физиологической реакцией в организме. Фотобиологические процессы многообразны, однако, каждый из них представляет собой последовательность определенных стадий: фотофизический процесс → фотохимические реакции → химические и биологические реакции → конечный биологический эффект.
Общая схема стадий фотобиологических процессов Поглощение света возбуждение молекул Миграция энергии Переход в триплетное состояние Развитие фотобиологического процесса при поглощении света не является единственно возможным вариантом трансформации световой энергии. Фотохимические реакции Биохимические реакции Физиологический акт Люминесценция Растрата энергии в тепло Возбужденные молекулы могут также расходовать свою энергию на тепло, высвечивание квантов люминесценции, на миграцию энергии между молекулами или переход в триплетное состояние.
Фотобиологические процессы можно разделить на позитивные и негативные. Негативные - под действием света происходят деструктивные изменения и поражение живой ткани (главным образом, под действием высокоэнергичных фотонов УФ - диапазона электромагнитных волн): фототоксические повреждения кожи, слизистых оболочек, глаз; фотоаллергические реакции. Позитивные фотобиологические процессы: зрение животных; фотопериодизм для всех процессов в природе; образование витамина D под действием света; фотосинтез у растений фототаксис и фотопериодизм у растений др. Фотопериодизм длительности и интенсивности солнечного освещения обеспечивает в живой природе суточные, сезонные и годовые ритмы, регулирует рост и развитие биологических объектов. Солнечное излучение поддерживает жизнь на Земле (фотоны необходимы для начальных стадий процесса фотосинтеза), определяет климат. Зелёный лист растения — источник жизни на Земле благодаря поступлению на Землю энергии Солнца
За счет фотосинтеза ежегодно на Земле в пересчете на углерод синтезируется 5· 1010 т органического вещества. При этом поглощается 2· 1012 т СО 2 и выделяется в атмосферу 13· 1010 т молекулярного кислорода. Суть фотосинтеза заключается в восстановлении СО 2 до углеводов за счет энергии света. При этом для всех растений и многих фотосинтезирующих микроорганизмов источником водорода служит вода. Итоговая реакция фотосинтеза имеет вид: СО 2 + H 2 O + свет → (СН 2 О) + О 2. (4. 3. 1. ) Здесь (СН 2 О) – фрагмент молекулы углевода. На образование одной молекулы О 2 расходуется 8 квантов света, и при фотореакции выделяется энергия 470 к. Дж/моль. Коэффициент использования солнечной энергии составляет примерно 30%. Для синтеза одной молекулы глюкозы необходимо по 6 молекул СО 2 и Н 2 О: 6 СО 2 + 6 Н 2 О + свет→ С 6 Н 12 О 6 + 6 О 2. (4. 3. 2. ) Каждая из представленных простых реакций, в действительности, содержит множество промежуточных этапов. Одни из них связаны с превращением световой энергии в химическую, другие являются ″темновыми реакциями″, так как могут происходить в темноте.
В фотобиологических процессах большую роль играет длина волны света, падающего на объект. Для света с длиной волны λ=480 нм энергии кванта Е = 4, 1· 10 -19 Дж. Такое значение энергии соответствует средней кинетической энергии молекул газа при температуре 200000 С. Т. е. освещение видимым светом изменяет и расщепляет молекулы, как нагревание до 200000 С. Спектр фотобиологического действия - зависимость фотобиологического действия от длины волны падающего на вещество света.
. , Уменьшение концентрации dn разрушаемых светом молекул для разбавленных растворов: Знак минуса в правой части означает уменьшение со временем числа активируемых молекул. Разделение переменных и интегрирование по времени t позволяет получить: Здесь D – доза облучения: где s - эффективное сечение поглощения молекулой фотона, φx – квантовый выход фотохимической реакции ( показывающий, какая доля молекул, поглотивших фотон, участвует в фотохимической реакции); I 0 – интенсивность падающего света; n – начальная концентрация молекул; dt – элементарный промежуток времени освещения. и – поперечное сечение молекулы при фотохимическом превращении: На графике зависимости является угловым коэффициентом, определяющим наклон прямой:
Спектром фотобиологического действия в фотохимии также называют зависимость поперечного сечения молекулы при фотохимическом превращении от длины волны ( ). Аналогично закону Вавилова для люминесценции квантовый выход фотохимических реакций в растворах не зависит от длины волны падающего света. Спектр действия по форме соответствует спектру поглощения вещества . Это позволяет, сопоставляя спектры действия и поглощения для различных биохимических соединений, определять, фотолиз какого элемента сложной системы отвечает за конечный физиологический эффект.
Спектр действия фотоинактивации трипсина (кривая 1). Кривая 2 соответствует спектру поглощения его главных хромофоров – триптофану, тирозину и цистину. Видно, что оба спектра близки друг к другу. Следовательно, для инактивации трипсина существенную роль играет фотолиз всех трех перечисленных хромофоров. Аналогично было установлено, что кривая спектра действия УФ – излучения на бактерии по форме и положению максимума близка к спектру поглощения нуклеиновых кислот. Это привело к выводу, что гибель бактерий под действием УФ – света происходит изза разрушения нуклеиновых кислот. λ, нм Фотомедициной называется раздел медицины изучающий терапевтическое применение или патологические последствия действия оптического излучения.
Скачать презентацию Люминесценция биологических систем Люминесценция представляет собой избыточное
Лек 12 Люминесценция биол. сист..ppt