Львівський національний медичний університет ім Данила Галицького кафедра

Львівський національний медичний університет ім. Данила Галицького кафедра клінічної імунології та алергології КЛІНІКО-ЛАБОРАТОРНА ОЦІНКА ІМУННОГО СТАТУСУ ЛЮДИНИ к. м. н. , доцент Галина Потьомкіна

n Імунним статусом називають стан імунної системи людини на момент обстеження, який оцінюється за допомогою стандартного комплексу інформаційних клініко-лабораторних даних

Показники природженого імунітету n Гуморальні: СРП, загальний комплемент, С 3, С 4, лізоцим n Клітинні: фагоцитарне число, фагоцитарний показник, НСТ (спонтанний стимульований), CD 16/CD 56 -лімфоцити, функцінальна активність NK n Місцевий імунітет: лізоцим

Показники набутого імунітету n Гуморальні: Ig. M, G, A, Е, ЦІК n Клітинні: CD 3, CD 4, CD 8, CD 22 n Місцевий імунітет: секреторний Ig А

Специфічні показники n Ревматодний фактор (антитіла класів Ig. G, Ig. M, Ig. A, Ig. Е до Fc-фрагменту Ig. G ) n Антистрептолізин “О” n Кріоглобуліни n Антитіл до клітинно-молекулярних структур (ДНК, антинуклеарних, тиреоглобулінів, мієліну, кардіоліпіну тощо) n Визначення специфічних антитіл та антигенів інфекційних збудників (ВПГ, ЦМВ, ВЕБ, Токсоплазми, хламідій тощо)

Функціональні спеціальні показники n Інтенсивність міграції, адгезії фагоцитів n РБТЛ на специфічні антигени n Тест гальмування міграції лімфоцитів n Активізаційні маркери (CD 71, CD 25, CD HLA-DR n n n ін. ) Визначення активності апоптозу Визначення рівня ІФН Визначення концентрації ІЛ-2, 4, 10 Визначення ФНП Визначення ростових факторів

І рівень скринінгових імунологічних досліджень n Лейкограма (з визначенням абсолютного числа ІКК) n Протеїнограма n СРП

Протеїнограма n До α-глобулінів відноситься основна маса білків n n гострої фази, які є інгібіторами протеаз. До фракції α 1 -глобулінів відносять α 1 -антитрипсин, α 1 глікопротеїд, кислий α 1 -глікопротеїн (орозумокоїд). До фракції α 2 -глобулінів відносять α 2 -макроглобулін, гаптоглобін, аполіпопроеїни А, В, С, церулоплазмін. Фракція β-глобулінів містить трансферин, гемопексин, С 2 -С 9 компоненти комплементу, ліпопротеїди, Среактивний білок, сироватковий амілоїд А. Фракція γ-глобулінів містить імунoглобуліни класів G, A, M, D, E (в основному Ig. G).

Визначення С-реактивного білка n Виявляється в сироватці крові при різних запальних і n n n некротичних процесах і є показником гострої фази їх протікання. Основна функція супресія імунної відповіді. сприяє безпосередній аглютинації та загибелі патогенних мікроорганізмів; сприяє знищенню бактерій, стимулюючи фагоцитоз, виступає опсоніном; Стимулює синтез хемотаксичних факторів; Запобігає автоімунізації організму: зв’язує автоантигени, пришвидшує кліренс імунних комплексів, модулює активацію В-лімфоцитів, через обмеження антитілоутворення. активує НК-клітини, сповільнює ріст пухлин; сприяє регенерації тканин після травм та хірургічних операцій

ІІ рівень імунологічних досліджень n Визначення омплементарної ктивності к а сироватки крові n Фагоцитарна активність n НСТ-тест (спонтанний і стимульованний) n Рівень імуноглобулінів класів М, G, А, Е n Визначення рівня ЦІК n Фенотипування лімфоцитів з використанням моноклональних антитіл

Визначення комплементарної активності До важливих функцій активованого комплементу відносяться: n Кіноподібна активність, посилення проникливості судин та скорочення гладеньких м’язів; n Посилення хемотаксису нейтрофілів та моноцитів, активація фагоцитозу; n Анафілаксія та виділення медіаторів анафілаксії з тучних клітин та базофілів; n Індукція синтезу метаболітів арахідонової кислоти; n Активація системи згортання крові та системи фібринолізу. n Разом з антитілами зв’язується з антигеном, утворюючи комплекс, який приймає участь у руйнуванні і знешкодженні чужерідних клітин. n Приймає участь в активації фактично всіх видів імунокомпетентних клітин.

Показники, які характеризують активність системи комплементу n Загальна комплементарна активність сироватки крові (КАСК). Оцінюється за 50% гемолізом еритроцитів –СН 50 n С 3 – компонент комплементу n С 4 – компонент комплементу

Методи оцінки фагоцитарної активності (світлова мікроскопія) Фагоцитарна активність НСТ-тест

Показники, які характеризують стан фагоцитозу n Фагоцитарний показник (ФП) – відсоток нейтрофілів, які приймають участь у фагоцитозі; ФП = кількість клітин з включеннями латексу х 100% загальну кількість підрахованих клітин n Фагоцитарне число – середня кількість часточок латексу, захоплених одним нейтрофілом крові. Характризує поглинальну здатність нейтрофілів. ФЧ = сумарна кількість часточок латексу в клітинах кількість клітин з включеннями латексу n Норма: Фагоцитарний показник – 50 -80 % Фагоцитарне число – 4 -9

НСТ-тест (спонтанний та стимульований) n Тест з нітросинім тетразолієм (НСТ-тест) відображає ступінь активації кисневозалежних механізмів бактерицидності фагоцитуючих клітин. n Спонтанний НСТ-тест з клітинами без стимуляції відображає ступінь функціонального подразнення фагоцитуючих клітин і їх здатність до кілінгу. n Стимульований НСТ-тест характеризує потенціальну активність фагоцитуючих клітин і розглядається як критерій їх готовності до завершеності фагоцитозу.

Методи оцінки фагоцитарної активності (проточна цитометрія) NC f. MLP E. coli РМА

Показники, які характеризують активність “оксидативного вибуху” n E. coli – специфічна стимуляція n f. MLP (N-formyl. Met. Leu. Phe) (хемотактичний пептид) – слабка фізіологічна стимуляція. Імітує активацію нейтрофілів бактеріальними антигенами n PMA (12 -myristate 13 acetate) (ліганд протеїнкінази С)– сильна стимуляція

Хворий Б. , 2 р. 5 міс хронічна гранулематозна хвороба?

Визначення рівня імуноглобулінів (загальних, специфічних) n Імуноферментний метод – твердовазний метод, який базується на використанні моноклональних антитіл кон”югованих з ферментом n Метод імунотурбодиметрії - базується на взаємодії білка з моноспецифічними антитілами з утворенням преципітатів імунних комплексів, що призводить до збільшення мутності розчину, величина якої прямопропорційна вмісту антитіл n Імунофлюоресцентний метод - базується на використанні моноклональних антитіл кон”югованих з флюорисцентною міткою n Метод імуноблоту - базується на використанні моноклональних антитіл кон”югованих з ферментом

Моно- і поліклональні антитіла Реагують зі специфічним епітопом антигену Реагують з різноманітними епітопама антигену

Імуноферментний метод

Визначення Ig. E специфічних антитіл до алергенів

Метод непрямої імунофлюорисценції

Типи світіння гомогенний зернистий ядерний цитоплазматичний

Діагностика органоспецифічних автоімунних захворювань

Виявлення антитіл інфекційних збудників C. trachomatis HSV 1 Toxoplasma gondii Cytomegalovirus Rubella virus EBV nucler antigen

Метод імуноблоту • Діагностика системних і органоспецифічних автоімунних хвороб • Діагностика інфекційних захворювань • Діагностика алергічних хвороб

Western-blot

Фенотипування лімфоцитів • Метод проточної цитофлюориметрії • Метод магнітної сепарації клітин • Імунофлюорисцентний метод • Метод розеткоутворення з еритроцитами барана

Поверхневі маркери лімфоцитів

Принцип методу проточної цитометрії CD 3 Л Л CD 45 CD 4 CD 8

Проточна цитометрія

Можливості застосування методу проточної цитофлюориметрії 1. Визначення кількості популяцій і 2. 3. 4. 5. 6. субпопуляцій лімфоцитів Визначення активізаційних маркерів лімфоцитів (CD 25, CD 69, CD 38 тощо) Визначення захоплюючої здатності нейтрофілів та моноцитів (фагоцитарний показник) Визначення метаболічної активності нейтрофілів, моноцитів Оцінка активності базофілів (медикаментозна алергія) Визначення цитокінів

Визначення активності базофілів в присутності алергена

Чутливість і специфічність методу FAST до різних медикаментів Препарат К-ть досл. Чутливість, % Специфіч. % Автор Міорелаксанти 11 21 54 90, 9 64 62 100 62 Leunaider, 1996 Abuaf et al, 1999 Monnert et al, 2002 Метамізол 15 33 100 Sanz et al. , 2001 ß-лактамні антибіотики 58 50 93, 3 Sanz et al. , 2001 ß-лактами при позитивних ШТ 52 52, 3 92, 3 Sanz et al. , 2001 ß-лактами при негативних ШТ 12 41, 6 92, 3 Sanz et al. , 2001 Аспірин 16 56, 3 100 de Weak et al. , 2002 Alain de Weck, M. Sanz // ACI International, 2002, Vol. 14, No 5, P. 204 -215.

Порівняння чутливості FAST методу з іншими тестами

Порівняння специфічності FAST методу з іншими тестами

Комбінація FLOW- і CAST-тестів збільшує чутливість методу до 80% Одна стимуляція – два результати Активовані клітини Супернатант Flow-CAST® Оцінка рівня CD 63 Оцінка рівня лейкотрієнів

n CRTH 2/DP 2 (CD 294) – експресуться на Th 2 -лімфоцитах і у великій кількості на базофілах n CD 203 с – маркер активованих базофілів. Експресуться тільки на базофілах. Після стимуляції алегеном рівень експресії зростає на 350% (рівень CD 63 на 100%) Фенотип активованих базофілів CD 294+/CD 203 с+/CD 3 -

Оцінка результатів Boumiza R. , 2005

n Тест трансформації лімфоцитів у присутності медикаментів n Оцінка результатів може проводитися за допомогою проточного цитометра за аналізом фаз клітинного циклу і оцінкою кількості клітин у S-фазі. Hans F. , 2002

ТРЕТІЙ РІВЕНЬ ІМУНОЛОГІЧНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ n n n n n Катіонно-білковий та мієлореоксидазний тести Активізаційні маркери (CD 71, CD 25, CD HLA-DR) С 3 -, С 4 -компоненти комплементу Визначення активності апоптозу РБТЛ на специфічні маркери, ТГМЛ Визначення специфічних інфекційних АТ, автоантитіл, онкомаркерів Визначення рівня кріоглобулінів Молекулярно-генетичні методи (ПЛР) Визначення рівня ІНФ, концентрації ІЛ, ФНП, ростових факторів Функціональна активність NK-клітин

n Катіонно-білковий тест – тест, який дозволяє оцінити активність кисневонезалежного механізму бакрицидності фагоцитів за рівнем катіонних білків в лізосомах. Мієлопероксидазний тест – характеризує кисневозалежний механізм фагоцитозу