Лектор – Леванова Людмила Александровна, д. м. н. , зав. кафедрой микробиологии, иммунологии и вирусологии ГЕНЕТИКА БАКТЕРИЙ (изменчивость и наследственность)
ОСОБЕННОСТИ Бактерии - гаплоидные организмы, в связи с этим отсутствует явление доминантности. Хромосома располагается свободно в цитоплазме, суперспирализирована, уложена в виде кольца и прикреплена к ЦПМ. Наличие генов-оперонов. Передача генетического материала происходит по вертикали и горизонтали.
ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА У БАКТЕРИЙ ДНК нуклеоид (бактериальная хромосома) жизненно важные признаки внехромосомные факторы наследственности не жизненно важные признаки
ВНЕХРОМОСОМНЫЕ ФАКТОРЫ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ автономные – являются репликоном плазмиды неавтономные - реплицируются только в составе репликона (хромосома или плазмиды) транспозоны IS-последовательности умеренные фаги
ВСТРАИВАНИЕ В НУКЛЕОИД ВНЕХРОМОСОМНЫХ ФАКТОРОВ НАСЛЕДСТВЕННОСТИ в гомологичных участках плазмиды умеренные фаги в любых участках транспозоны IS-последовательности
ПЛАЗМИДЫ определение внехромосомные автономные кольцевые и суперспирализованные молекулы ДНК, размеры которых от 1, 5 до 200 м. Д функции 1. регуляторная – компенсирует нарушение функции ДНК нуклеоида 2. кодирующая – кодирует и вносит в генотип новую информацию возможные состояния автономное (в цитоплазме) интегрированное (в нуклеоиде)
ПЛАЗМИДЫ строение 1. Гены саморепликации 2. Структурные гены 3. Tra-оперон (крупные плазмиды) содержание tra-оперона Конъюгативные (трансмиссивные) плазмиды (содержат) неконъюгативные (мобилизируемые) плазмиды (не содержат)
ФУНКЦИИ TRA-ОПЕРОНА детерминирует образование конъюгативных пилей мобилизирует на перенос конъюгативную плазмиду неконъюгативную плазмиду участок нуклеоида
Виды плазмид и кодируемые признаки R-плазмиды-лекарственную устойчивость Col-плазмида-синтез колицинов Hly-плазмида –синтез гемолизинов Tox-плазмиды – синтез токсинов F-плазмида – передача генетической информации Плазмиды биодеградации – разрушение субстратов (белков, сахаров)
Общемедицинское значение плазмид Контролируют синтез факторов патогенности, в том числе у представителей нормальной микрофлоры тела человека Участвуют в распространении генов резистентности к химиотерапевтическим средствам и дезинфектантам, что лежит в основе формирования госпитальных штаммов
F-ПЛАЗМИДЫ определение половой фактор (только tra-оперон, никаких других генов) состояние интегрированное Hfr-штаммы автономное F- штаммы
R-ПЛАЗМИДЫ определение плазмиды множественной лекарственной устойчивости состав r-оперон(-ы) + tra-оперон r-оперон(-ы) пути передачи при трансдукции (грамположительные бактерии) при конъюгации (грамотрицательные бактерии)
Состав r-оперона гены, детерминирующие синтез ферментов инактивирующие антибиотик модифицирующий антибиотик снижающие проницаемость клеточной стенки бактериальной клетки к антибиотику может содержать транспозон IS-последовательность
Механизмы устойчивости бактерий к антибиотикам, обусловленные наличием R-плазмид инактивация антибиотика модификация антибиотика снижение проницаемости бактериальной клеточной стенки к антибиотику
БАКТЕРИОЦИНОГЕННЫЕ ПЛАЗМИДЫ (на примере Col-плазмиды E. coli) определение плазмиды, детерминирующие синтез колицинов (антибиотикоподобных веществ) состав гены, детерминирующие синтез колицина tra-оперон особенности 1. 2. 3. редко интегрируют в нуклеоид обычно репрессированы при их дерепрессии бактериальная клетка синтезирует колицины и погибает (потенциально летальная плазмида) биологическое значение «разрежение» бактериальной популяции при истощении питательной среды медицинское значение участвуют в нормализации естественного микробиоценоза кишечника
Характеристика колицинов белки более 25 типов не действуют на клетку, несущую Colплазмиду такого же типа убивают бактериальную клетку, но не лизируют её
ТРАНСПОЗОНЫ определение нуклеотидные последовательности (от 2 000 до 20 000 пар нуклеотидов), способные менять место своей локализации в молекуле ДНК и мигрировать из одной молекулы ДНК в другую состояние в бактериальной клетке 1. интегрированное в репликон (реплицируется вместе с ним) 2. автономное (замыкается в кольцо и не реплицируется) состав особые концевые структуры, которые отличают транспозон от др. фрагментов ДНК (маркеры транспозона) гены транспозиции гены, детерминирующие синтез токсинов ферментов, обеспечивающих устойчивость к антибиотику белков, обеспечивающих др. признаки
Функции транспозонов 1. координация взаимодействия внехромосомных факторов наследственности между собой и с бактериальной хромосомой для обеспечения их рекомбинации 2. регуляторная (регуляция транскрипции генов путём их «включения/выключения» ) 3. индукция мутаций (инверсии, дупликации на протяжении 5 -9 пар нуклеотидов)
IS-ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ определение вставки нуклеотидных последовательностей (порядка 1 000 пар нуклеотидов) отличия от транспозонов 1. содержат только гены транспозиции 2. не обнаружены в свободном состоянии функции 1. координация взаимодействия внехромосомных факторов наследственности между собой и с бактериальной хромосомой для обеспечения их рекомбинации 2. регуляторная (регуляция транскрипции генов путём их «включения/выключения» ) 3. индукция мутаций (инверсии, дупликации на протяжении 5 -9 пар нуклеотидов)
Бактериофаг µ Подобно Is-элементам и транспозонам может интегрировать в любой участок ДНК бактерий и обусловливать мутагенный эффект
Схематическое изображение Is-элементов и транспозонов
ИЗМЕНЧИВОСТЬ Фенотипическая (модификация); Генотипическая: - мутации; - рекомбинации.
МЕХАНИЗМЫ ФАГОВОЙ КОНВЕРСИИ встраивание в нуклеоид бактериофага активация гена бактериофага внесение гена от бактерии-донора (дефектные фаги при трансдукции) встраивание около повреждённого промотора замена его фаговым промотором экспрессия «молчащих» генов бактерииреципиента появление у бактерии-реципиента нового признака
МОДИФИКАЦИИ У БАКТЕРИЙ Фенотипические изменения у бактерий не сопровождаются изменениями первичной структуры ДНК, а представляют собой временные изменения фенотипа, возникающие в процессе адаптации бактерий к новым условиям обитания. Не передаются по наследству С устранением факторов, приведших к их появлению вскоре утрачиваются (реверсируют)
Виды модификаций Кратковременные - сохраняются только в первых генерациях после устранения вызвавших их факторов (лабильные), Длительные - наблюдаются в течение ряда поколений после устранения фактора (стабильные)
МУТАЦИИ У БАКТЕРИЙ Определение Изменения в первичной структуре ДНК, которые выражаются в наследственно закреплённой утрате или изменении какого-либо признака (ов)
КЛАССИФИКАЦИЯ МУТАЦИЙ По происхождению спонтанные – трудно или невозможно связать с действием определённого фактора (мутагена) ошибки в работе ДНК-полимеразы при репликации ДНК инсертационные – при встраивании в нуклеоид внехромосомных факторов наследственности индуцированные – в эксперименте под воздействием мутагена
КЛАССИФИКАЦИЯ МУТАЦИЙ По направленности: прямые – потеря или изменение признака обратные (реверсии) – восстановление признака истинные – восстанавливается и фенотип и генотип супрессорные – восстанавливается только фенотип
Мутации у бактерий Классификация по протяженности: Генные-мутации в пределах одного гена Хромосомные - захватывают несколько генов, к ним относят: Делеции Инверсии Дупликации Транслокации
КЛАССИФИКАЦИЯ МУТАЦИЙ По протяженности: Точковые-изменения одной пары нуклеотидов в молекуле ДНК, в результате выпадения или вставки азотистых оснований. Точковые мутации делят на: Простые (транзиции) – замена пурина на пурин или пиримидина на пиримидин Сложные (трансверсии) – замена пурина на пиримидин или пиримидина на пурин
Последствия точковых мутаций Замена одного кодона на другой (одной а. к. на другую). Сдвиг рамки считывания, что ведет к изменению целой серии последовательностей а. к. Возникновение «бессмысленного» кодона (УАГ, УГА, УАА), что ведет к прекращению трансляции
SR-ДИССОЦИАЦИИ определение появление в чистой культуре, образующей S-формы колоний, Rформ колоний как внешнее проявление изменений свойств образующих их бактериальных клеток механизм инсертационная мутация, приводящая к утрате генов, контролирующих синтез полисахаридных звеньев ЛПС наружной мембраны клеточной стенки биологическое значение R-формы более устойчивы к физико-химическим факторам внешней среды S-формы более устойчивы к фагоцитозу и действию антител Значительно усложняют выделение и идентификацию чистой культуры
S и R формы колоний
МУТАГЕНЫ Определение Химические вещества или физические факторы, вызывающие предмутационные изменения в ДНК, которые в результате ошибок репарирующих ферментов или в процессе репарации переходят в мутацию
МУТАГЕНЫ 1. Физические (УФ-излучение, R-лучи) 2. Химические (бензпирен, азид натрия, 5 бромурацил, 2 аминопурин, азотистая кислота) 3. Биологические (транспозоны, µбактериофаги, Is –элементы)
КЛАССИФИКАЦИЯ МУТАГЕНОВ По механизму действия 1. аналоги азотистых оснований замена пар оснований 2. акридиновые красители выпадения или вставки оснований 3. УФ, некоторые продукты микробного метаболизма нарушение работы ДНК-полимеразы образование тиминовых димеров 4. нитрозосоединения множественный эффект ( «супермутагены» )
РЕПАРАЦИИ Определение Процесс восстановления повреждённой ДНК ферментами репарационных систем
Виды репарационных систем Система фотореактивации – ферменты активны в присутствии видимого света Система темновой репарации – ферменты действуют в темноте
Этапы репарации 1. Обнаружение и надрезание поврежденного фрагмента ДНК эндонуклеазой 2. Удаление вырезанного фрагмента ДНК-полимеразой 1 3. Синтез нуклеотидов по матрице второй сохранившейся нити – работает ДНК-полимераза 1 и 3 4. «Сшивание» восстановленного фрагмента ДНК с основной нитью за счет лигазы
Этапы репарации
РЕКОМБИНАЦИОННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ У БАКТЕРИЙ Определение Изменчивость, происходящая в результате включения в ДНК реципиентной клетки участка ДНК донорской клетки
Виды рекомбинаций Законная – происходит спаривание гомологичных генетических структур за счет образования водородных связей между комплементарными нуклеотидами Незаконная – при встраивании в любом месте ДНК бактерий транспозонов, Is - элементов
Пути передачи генетического материала при рекомбинациях Виды 1. Трансформация – непосредственная передача генетического материала от донорской к реципиентной клетке 2. Трансдукция – передача генетического материала от донорской к реципиентной клетке с помощью дефектных бактериофагов неспецифическая (общая) абортивная специфическая
РЕКОМБИНАЦИОННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ У БАКТЕРИЙ Определение Изменчивость, происходящая в результате включения в ДНК реципиентной клетки участка ДНК донорской клетки
Виды рекомбинаций Законная – происходит спаривание гомологичных генетических структур за счет образования водородных связей между комплементарными нуклеотидами Незаконная – при встраивании в любом месте ДНК бактерий транспозонов, Is - элементов
РЕКОМБИНАЦИОННАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ У БАКТЕРИЙ Виды 1. 2. 3. 4. 5. Трансформация – непосредственная передача генетического материала от донорской к реципиентной клетке Трансдукция – передача генетического материала от донорской к реципиентной клетке с помощью дефектных бактериофагов неспецифическая (общая) абортивная специфическая Конъюгация – передача генетического материала от донорской к реципиентной клетке с помощью конъюгационных пилей Лизогенизация Фаговая конверсия
Этапы трансформации 1. Выделение ДНК из клетки-донора в результате разрушения и адсорбция на рецепторах бактерииреципиента 2. Разрезание эндонуклеазой двунитевой ДНК на отдельные двунитевые фрагменты 3. Эндонуклеаза вызывает деградацию одной из нитей двунитевых фрагментов ДНК
Этапы трансформации 4. Синтез белка-лоцмана, который соединяется с фрагментом ДНК и переносит их цитоплазму 5. Интеграция поступившего однонитевого фрагмента ДНК в ДНК клетки-реципиента
Пути передачи генетического материала при рекомбинациях Конъюгация – передача генетического материала от донорской к реципиентной клетке с помощью конъюгационных пилей. Идет в 2 стадии: 1. Контакт поверхности клетки-донора и клетки-реципиента посредством половых пилей. 2. Прохождение генетического материала через конъюгативный мостик
Механизм конъюгации Бактерии-доноры должны обладать F-плазмидой, которая кодирует образование sex-пилей. С помощью них донор находит реципиента, прикрепляется и затем подтягивает его к себе. Клеточные стенки бактерий входят в тесный контакт
Конъюгация при наличии F-плазмиды в свободном состоянии
Пути передачи генетического материала при рекомбинациях Трансдукция – передача генетического материала от донорской к реципиентной клетке с помощью бактериофагов неспецифическая (общая) абортивная специфическая
Трансдукция у бактерий
ГЕННАЯ ИНЖЕНЕРИЯ В МЕДИЦИНСКОЙ МИКРОБИОЛОГИИ
Получение рекомбинантной вакцины для профилактики гепатита В встраивание гена вируса гепатита В, детерминирующего синтез HBs-Ag в геном дрожжевой клетки манифестация гена синтез дрожжевой клеткой HBs-Ag очистка HBs-Ag вакцина, содержащая HBs-Ag, но не содержащая вирусных частиц или их фрагментов
Продукты, получаемые генно-инженерным способом с помощью рекомбинантных штаммов бактерий вакцины гормоны интерфероны цитокины
МЕТОД МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ Цель Выявления степени сходства различных ДНК (при идентификации микроорганизмов – сравнение ДНК выделенного штамма с ДНК эталонного штамма)
МЕТОД МОЛЕКУЛЯРНОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ Принцип осуществления исследуемая ДНК нагрев в щелочной среде расплетение на две отдельные нити закрепление одной из них на специальном фильтре помещение этого фильтра в р-р, содержащий радиоактивный зонд (одноцепочечную молекулу ДНК эталонного штамма, меченную радиоактивным изотопом) понижение температуры + - восстановление двойной спирали – - двойная спираль не восстанавливается
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ Цели обнаружение в патологическом материале конкретного вида микроорганизма без выделения чистой культуры идентификация микроорганизмов генотипирование микроорганизмов
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ Принцип осуществления патологический материал или штамм микроорганизма выделение ДНК нагрев расплетение ДНК на две нити добавление праймеров (участки ДНК, комплементарные 3’-концам искомого гена) охлаждение связывание праймеров с комплементарными участками искомого гена
ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ Принцип осуществления добавление ДНК-полимеразы и нуклеотидов нуклеотиды присоединяются к 3’-концам праймеров повторение циклов (30 -80) – накопление (амплификация) искомого гена резкое нарастание (двукратное после каждого цикла) количества искомого гена определение количества ДНК с помощью электрофореза + - количество ДНК увеличивается – - количество ДНК не увеличивается
Спасибо за внимание