ЛЕКЦИЯ Вирус гепатита С молекулярная биология клиниколабораторные

ЛЕКЦИЯ Вирус гепатита С ― молекулярная биология, клиниколабораторные аспекты и противовирусные препараты для лечения хронического гепатита С Hepatitis C virus travelling in the bloodstream. Source: Boehringer Ingelheim

Вирусные гепатиты — масштабная угроза общественному здоровью и глобальная проблема здравоохранения В мире более 150 млн носителей хронического вирусного гепатита С. Ежегодно около 4 млн чел. инфицируются вирусным гепатитом С и 500 тыс. чел. умирает от болезней печени, связанных с этим вирусом. Всемирная организация здравоохранения (ВОЗ)

Вирусный гепатит С — «ласковый убийца» Прогрессия повреждения печени при инфекции вирусом гепатита С Здоровая печень Фиброз печени Цирроз печени Рак печени Бессимптомное течение болезни!

План лекции Вирусный гепатит С ― исторический экскурс Идентификация вируса гепатита С Строение вируса гепатита С Организация генома вируса гепатита С Жизненный цикл вируса гепатита С Вариабельность вируса гепатита С Симптомы при вирусном гепатите С и его диагностика Лечение вирусного гепатита С Принципы разработки препаратов противовирусного действия Перспективы терапии вирусного гепатита С Заключение

Вирус гепатита С ― исторический экскурс Heim, 2013

Идентификация ВГС ◦ 1970 -е гг: разработана диагностика гепатита А и В. ◦ При переливаниях крови развивался гепатит, который не был вызван ВГА и ВГВ или другими известными вирусами Гепатит ни А, ни В (НАНВГ) ◦ Предполагалось, что существует вирус мелкий вирус, передаваемый шимпанзе ◦ Стандартными иммунологическими методами не удавалось обнаружить вирусные антитела или антигены ◦ Хайрон и коллеги предположили, что недостаточна концентрация антигена вируса НАНАГ. ◦ Попытка сконцентрировать вирус с использованием библиотеки к. ДНК источника инфекции

Стратегия идентификации вируса гепатита С Высокий титр НАНВГ в плазме шимпанзе Ультрацентрифугирование при 140 0000 оборотах, 5 ч Экстракция нуклеиновой кислоты, random primed к. DNA в фаг gt 11 Иммуноскрининг плазмы пациента с НАНВГ (около 1 млн клонов) Клон 5 -1 -1 Клон 81 (с большим перекрыванием)

Скрининг геномной библиотеки Фаг с фрагментами генома НАНВГ Инфицирование E. coli Фаг уничтожает E. coli и оставляет бляшки Скрининг с сывороткой пациента с вирусным гепатитом НАНВГ

Саузерн блот анализ клона 81 Печень инфицированной шимпанзе Острый Хронический Клон 81 проба Плацента Проба IFN- (контроль) Клоны 5 -1 -1 и 81 не являются производными человека или шимпанзе

e as RN as DN Ct 2 4 12 g rl e. I A Нозерн блот анализ клона 81 Infected Chimp Liver un Uninfected Chimp Liver d. T o O lig bo u nd Uninfected Chimp Liver Strand 1 Clone 81 probe Strand 2 Clone 81 probe Viral RNA ds 81 Клоны гибридизуются с РНК инфицированных животных, размер одноцепочечной РНК примерно 10000 нуклеотидов

Вестерн блот 5 PS SO D Clone 5 -1 -1 expressed as SOD fusion protein called PS 5 NANBH patient serum Experimentally infected chimp serum Protein from clone 5 -1 -1 closely associated with NANBH infections

April 21, 1989 Первый вирус был изолирован и охарактеризован исключительно с использованием молекулярных методов , без использования методов культивирования

Строение вируса гепатита С Shimoike [et al. ], 1999; Wakita [et al. ], 2005)

Трансмиссионная электронная микроскопия частиц вируса гепатита С https: //ru. wikipedia. org/wiki

Локализация вируса гепатита С в цитоплпазме гепатоцита ER — эндоплазматический ретикулум; M — митохондрия; N — ядро Gosert [et al. ], 2003) Gosert [ et al. ], 2003)

Организация генома вируса гепатита С Rehermann [et al. ], 2009

Строение и организация генома вируса гепатита С ― ключевые моменты Семейство Flaviviridae, род Hepacivirus Мелкий РНК-содержащий вирус — размер 50 -70 нм. Вирусный нуклеокапсид имеет форму икосаэдра. На поверхности вириона есть выступы высотой 6— 8 нм — «гликопротеиновые шипы» белки Е 1 и Е 2. Во внутренней оболочке вируса имеется нуклеокапсид (core), в котором инкапсулирована одноцепочечная молекула вирусной РНК (+ цепь) длиной 9 600 нуклеотидов. РНК вируса транслируется в полипротеин, затем индивидуальные белки высвобождаются из полипротеина при действии протеаз вируса и клетки-хозяина (гепатоцита).

Жизненный цикл вируса гепатита С

Рецепторы/факторы интернализации вируса гепатита С GAGs CD 81 (Barth et al. , 2003) (Pileri et al. , 1998) Линейные полисахариды на поверхности всех клеток человека Рецепторы семейства тетраспанинов. Intracellular Компонент рецепторного комплекса В-клеток SR-BI (Scarcelli et al. , 2002) Claudin-1 (Evans, von Hahn et al. , 2007) Класс скавенджер-рецепторов Form the backbone of tight класса I B семейства рецепторов junction strands in epithelial ЛПВП tissues Экспрессируются е в гепатоцитах, Highest expression in hepatocytes (less elsewhere) коре надпочечников, гонадах LDL-R (Agnello et al. , 1999) Рецептор липопротеинов низкой плотности

-репликация ВГС происходит на мембране ER -белки связываются с мембранами

Белки гепатоцита необходимы для репликации вируса гепатита С

Липидные капли и сборка вируса - детекция методом флуоресценции белка core, белка NS 5 A и белка адипофилина (он входит в состав липидной капли) -методом конфокальной микроскопии с использованием флуоресцентных меток можно увидеть формирование вирусной частицы

- core белок вируса играет ключевую роль сборке вируса в липидной капле drives assembly at the lipid droplet - Липидная капля связывается с core белком, затем NS 5 A и другие NS белки

Жизненный цикл вируса гепатита С ― ключевые моменты Комплекс белков опосредует вхождение вируса в гепатоцит: CD 81, Scavenger Receptor B 1, Claudin 1, Occludin, рецептор протеинов очень низкой плотности. РНК вируса не интегрируется в геном хозяина (в отличии от ВИЧ). Белки вируса взаимодействуют с мембранами эндоплазматического ретикулума, месте репликации вируса. Сборка вириона происходит в липидных каплях. Вирус покидает гепатоцит, используя путь секреции аполипопротеина В. Жизненный цикл вируса тесно связан с метаболизмом липидов. Период полужизни 3 часа. Ежедневно образуется 1 трлн вирионов.

Вариабельность вируса гепатита С ― генотипы, субтипы РНК-зависимая РНК-полимераза не имеет функции коррекции ошибок Мутации возникают в ходе репликации вируса, репарация генома вируса не происходит ◦ Генотипы Генетически отличаются и группируются по филогенетически

Генотипы и квазивиды вирусов гепатита С Тип Определение % сходства Генотип Неоднородность среди различных вирусов 66 – 69 Субтипы Близкие вирусы внутри каждого генотипа 77 – 80 Квазивиды Комплекс генетических вариантов у отдельных вирусов 91 – 99

Генотипы вируса гепатита С Выделяют семь основных генотипов вируса и множество субтипов. Наиболее частый и агрессивный 1 а (чаще выявляется в США) и 1 b генотипы (в Европе и в Российской Федерации). Генотипы 3 а чаще выявляют у наркопотребителей, генотип 2 в районе Средиземноморья, 5 -й и 6 -й генотипы чаще в Европе, а 7 -й новый генотип выделен в Канаде. В Санкт-Петербурге носители HCV-инфекции с 1 b генотипом составляют 47, 6 %, с 2 а генотипом — 11, 4 и с 3 а — 31, 4 % (Рахманова А. Г. [и др. ], 2014).

Вариабельность вируса гепатита С ― генотипы, субтипы ― ключевые моменты Высокая скорость мутирования вируса 1 мутация на 1000 оснований в год. 7 основных генотипов. Более 50 субтипов. Квазитипы у каждого индивидуального пациента. В РФ превалирует генотип 1 b.

Симптомы при вирусном гепатите С и его диагностика Скрытый (инкубационный) период при гепатите С составляет около 50 дней (от 20 до 140). Симптомы гепатита С могут не проявиться никогда. Какие-либо проявления инфекции могут вообще быть обнаружены только тогда, когда гепатит перейдет в цирроз.

Клиническое и вирусологическое течение острой и хронической инфекции гепатитом С Острый гепатит С Хронический гепатит С

Принципы разработки препаратов противовирусного действия

Молекулярные мишени вируса гепатита С и гепатоцита, участвующие в жизненном цикле вируса Вирусные и клеточные факторы в жизненном цикле вируса и их функции

Интерфероны (IFN) – это гликопротеины, которые стимулируют иммунную систему. Также активируют РНКазу L, которая расщепляет РНК ВГС. IFN-α применяется в виде инъекций для лечения ВГС. Полиэтиленгликоль Пегилированные IFN имеют улучшенные фармакокинетические свойства: растворимость и увеличенный период полужизни. Недостатки терапии: тяжелые побочные явления, неответ на терапию.

Рибавирин • Рибавирин является пролекарством, которое близко по строению с нуклеозидам РНК. Включается в РНК ВГС вместо аденина и гуанина и взывает мутации в РНК ВГС. • Рибивирин блокирует синтез вирусной РНК и, соответственно, репликацию ВГС. • Побочные эффекты: гемолитическая анемия, тератогенность. Crotty, et al. , 2002

Недостатки терапии интерферонами и рибавирином Действует только на 40 -50% пациентов. Развивается резистентность к терапии или рецидивы заболевания. Вызывают побочные эффекты: усталость, лихорадка, головные боли, депрессия , бессонница, кашель, кожная сыпь, боль в груди.

Принцип действия лекарства Вирусный гепатит С Белки вируса гепатита С Синтетическое вещество – ингибитор (лекарство) Активный центр белка Ингибирование работы активного центра белка Белки гепатоцита Выздоровление

Этапы создания лекарства Противовирусный эффект и токсичность на клеточных культурах моделях животных доклинические испытания 1. Идентификация биомишени Дальнейшая оценка II и III фазы клинических испытаний 2. Валидация биомишени 3. Идентификация соединения- лидера 4. Оптимизация соединения-лидера Лекарствокандидант Токсичность и побочные эффекты у человека I фаза клинических испытаний Лекарство для продажи IV фаза клинических испытаний

Разработка нового лекарства – трудоемкая и затратная задача - 1 из 1000 перспективных лекарств получает разрешение для терапии -1 из 5 лекарств получает разрешение FDA

микро. РНК и вирус гепатита С Долгое время было неизвестно, как РНК вируса может сохраняться в печени инфицированных пациентов в течение десятилетий. Открытие роли микро. РНК (ми. РНК) в экспрессии генов позволило понять механизм длительной персистенции HCV-инфекции. Ми. РНК — это короткие некодирующие (длиной около 20— 25 нуклеотидов) молекулы рибонуклеиновых кислот, регулирующие экспрессию генов.

Механизм действия микро. РНК и ее роль в жизненном цикле вируса

Закрытая нуклеиновая кмлота (locked nucleic acid) – мираверсен - ингибитор ми. РНК-122 (mi. R-122) 8 LNA, 7 DNA Мираверсен mi. R-122 RISC AAAAA Ингибирование экспрессии

Закрытая нуклеиновая кмлота (locked nucleic acid) – мираверсен - ингибитор ми. РНК-122 (mi. R-122)

Введение в молекулу биоизостеров Биоизостеры - структурно различные, но биофункционально эквивалентные молекулярные фрагменты Meanwell, 2014

Докинг, скоринг и скрининг – основополагающие подходы в конструировании лекарств Докинг – позиционирование лиганда в активном центре белка Скоринг – оценка энергии связывания лиганда с белком Скрининг – перебор крупных баз данных молекул

Новые мишени: протеаза NS 3 РНК ВГС кодирует полипротеин длиной 3000 аминокислотных остатка. Полипротеин подвергается протеолизу протеазой вируса и гепатоцита с образованием структурных и неструктурных белков. Неструктурные (NS) белки подвергаются действию вирусных протеаз NS 2/3 и NS 3.

Протеаза NS 3 Сериновая протеаза состоит из 180 аминокислотных остатка. Аминокислоты His-57, Asp-81 и Ser-139 образуют каталитическую триаду. Для активации NS 3 связывается с кофактором NS 4 a. Каталитический регион расположен на N-концевой части белка NS 3. Каталитический сайт расположен на поверхности фермента. http: //www. biomedcentral. com/1472 -6807/5/1

Два типа ингибиторов протеазы NS 3 α-Кетоамиды. Обратимо образует ковалентную связь с серином в каталитическом сайте. • • • Конкурентные ингибиторы, которые имеют большее сродство, чем субстрат. Связываются за счет нековалентных взаимодействий. http: //www. biomedcentral. com/1472 -6807/5/1

Механизм действия α-кетоамидов Это пептиды, содержащие электрофильную группу которая способна ковалентно связываться с остатком Ser-139 активного центра фермента (реакция обратима)

Механизм действия сериновой протеазы NS 3

Докинг (docking) Правильное позиционирование лиганда в активном центре белкамишени: поиск глобального минимума энергии на очень сложной энергетической поверхности. Гибкий лиганд в воде Протеаза NS 3 - белок-мишень Protein Data Bank или PDB: www. rcsb. org/pdb

Скоринг (scoring) Правильная оценка энергии связывания белок-лиганд Учитывает слабые межмолекулярные взаимодействия Высокая точность: около 1 kcal/mol или 0. 05 e. V Сулимов, 2009

Скрининг

Препараты прямого противовирусного действия Европейская ассоциация по изучению печени (EASL, 2015) представила на 50 -м международном конгрессе в г. Вена обновленные рекомендации по лечению хронического вирусного гепатита С (ХГС). Руководство включает новейшие безинтерфероновые режимы терапии на базе недавно одобренных в странах Европейского союза препаратов прямого противовирусного действия (ПППД). Схемы лечения ХГС представлены как для моноинфекции, так и для ВИЧ-коинфекции, а также для пациентов с циррозом печени и без такового.

Препараты прямого противовирусного действия Конечной целью противовирусной терапии является полная эрадикация HCV-инфекции, а также предупреждение аутоиммунных и метаболических заболеваний, включая поражения щитовидной железы и сахарный диабет, развития патологии почек и других внепеченочных проявлений. Революционный переворот в противовирусной терапии ХГС был сделан благодаря разработке ПППД

Препараты прямого противовирусного действия Препарат Класс препарата Компания Фаза испытаний/ утверждение в РФ Телапревир NS 3/4 А « «Janssen» Одобрен Боцепревир NS 3 «Merck» , «Р-Фарм» Одобрен Симепревир NS 3/4 А «Medivir» , « «Janssen» Одобрен «Викейра Пак» NS 5 АNS 5 BNS 3/4 А «Abbvie» Одобрен Нарлапревир NS 3 «Р-Фарм» , «Merck» В процессе утверждения Асунапревир NS 3 «Bristol-Myers Squibb» Одобрен Даклатасвир NS 5 A «Bristol-Myers Squibb» Одобрен Софосбувир NS 5 B «Gilead Sciences» IV Фалдапревир NS 3/4 А «Boehringer Ingelheim» III Ванипревир NS 3/4 А «Merck Abbvie» III Данопревир NS 3/4 А «Roche» , «Intermune» III Гразопревир NS 3/4 А «Merck» III

Симепревир в терапии вируса гепатита С с генотипом 1 Симепревир ( «Совриад» , олизия) — ингибитор вирусной протеазы ВГС NS 3/4 A

Устойчивый вирусологический ответ через 12 нед. после окончания лечения у пациентов ранее не получавших лечение (данные исследования QUEST-1) Симепревир 150 мг + PR, 12 недель

«Викейра Пак» — комбинированный противовирусный препарат структурная формула дасабувира структурная формула омбитасвира Ритонавир фармакокинетический структурная формула паритапривира усилитель за счет ингибирования изофермента цитохрома — СYР 3 А.

Мишени противовирусного действия комбинированного препарата Викейра Пак

Схема лечения и ее продолжительность для разных пациентов (впервые начинающих лечение или после терапии интерфероном) Группа пациентов Генотип 1 a, без цирроза Лекарственные препараты* «Викейра Пак» + РИБ Продолжительность 12 нед. Генотип 1 a, с циррозом «Викейра Пак» + РИБ 24 нед. ** Генотип 1 b, без цирроза «Викейра Пак» 12 нед. Генотип 1 b, с циррозом «Викейра Пак» + РИБ 12 нед. Рекомендуемая доза препарата «Викейра Пак» включает 2 таблетки: омбитасвир + паритапревир + ритонавир 12, 5 мг + 75 мг + 50 мг один раз день утром и дасабувир 250 мг 2 раза в день утром и вечером.

Высокая частота УВО у пациентов с генотипом 1 b и компенсированным циррозом печени

Препараты даклатасвир, асунапревир и беклабувир Структурная формула даклатасвира Структурная формула беклабувира Структурная формула асунапревира

Стадии жизненного цикла вируса гепатита С в качестве мишеней их блокирования с помощью новых препаратов прямого противовирусного действия протеолиз полипротеина — NS 3/4 A, репликация РНК — NS 5 B, репликация РНК и сборка вирионов — NS 5 A

Вирусологический ответ через 12 нед. после окончания терапии Пациенты получали ДКВ в таблетках по 60 мг один раз в день и АСВ в капсулах по 100 мг 2 раза в день

Заключение Необходимы лекарства с меньших числом побочных эффектов, отсутствием резистентности, доступностью и низкой ценой. Разработка вакцины.

Вопросы для размышлений Зная стадии жизненного цикла вируса гепатита С, как вы думаете, какая стадия самая уязвимая и, воздействуя на которую можно создать наиболее эффективный препарат противовирусного действия? Исследования показали, что многокомпонентная терапия (т. е. воздействие на 2 или 3 различные белковые мишени вируса) гепатита С препаратами прямого противовирусного действия наиболее эффективна. Будет ли эффективна многокомпонентная терапия антибактериальными препаратами в отношении бактериальной инфекции?

Рекомендуемая литература Жданов К. В. , Лобзин Ю. В. , Гусев Д. А. [и др. ]. Вирусные гепатиты. — СПб. : Фолиант, 2011. — С. 304. Михайлов М. И. Вирусы гепатита // Клиническая гепатология. — 2009. — № 1. — С. 15— 24. Ющук Н. Д. , Знойко О. О. , Климова Е. А. Вирусные гепатиты. — М. : ГЭОТАР — Медиа, 2012. — С. 320. Яковлев А. А. , Виноградова Е. Н. , Рахманова А. Г. Хронические вирусные гепатиты. — СПб. : Изд-во НИИХ СПб. ГУ. — 287 с. Pawlotsky J. M. New hepatitis C therapies: the toolbox, strategies, and challenges. Gastroenterology 2014; 146: 1176 — 1192. Zeisel M. [et al. ] Hepatitis C virus entry: molecular mechanisms and targets for antiviral therapy // Front Biosci. — 2009. — Vol. 14. — P. 3274— 3285.

Спасибо за внимание!