Лекция: Патогенность и вирулентность. Генетика бактерий и вирусов «Случай благоприятствует подготовленному геному» Линн Капорале «Мы можем понять что-то в природе, только если мы размышляем о ней…» Вернер Гейзенберг Лектор: доцент кафедры Темникова Наталья Владимировна 1
Ключевая фраза • Очевидно, что эволюция генов и эволюция геномов — процессы различные. Предметом данной лекции является эволюция ПАТОГЕННОСТИ бактериальных геномов. При этом основное внимание будет уделено не наследованию и распространению признаков в крупных популяциях, а механизмам первичных процессов приобретения и потери генетического материала 2 индивидуальными геномами.
Патогенность (от греч. páthos — страдание, болезнь и -genés — рождающий, рожденный), болезнетворность, способность микроорганизмов вызывать появление инфекционной болезни. П. зависит от вирулентности инфекционного агента и восприимчивости инфицируемого организма. Таким образом, П. — понятие относительное, связанное для каждого микроба с видом, возрастом, полом и физиологическим состоянием организма, в который он внедряется. П. возникла в процессе эволюции микробов в результате длительной адаптации их к определённым видам организмов. Отдельные штаммы того или другого 3
Вирулентность • В. — не видовой признак микроба (вируса) и может колебаться в широких пределах у разных штаммов. Изменение В. может быть вызвано искусственными воздействиями, например нагреванием, облучением, химическим и другим, которые применяются для получения живых вакцин. С этой же целью многократно пересевают инфекционный агент (например, вирус уличного бешенства— через мозг кроликов, в результате чего В. вируса для человека снижается и он может быть использован для прививок против бешенства). 4
Вирулентность • (от лат. Virulentus — ядовитый), степень болезнетворности (патогенности) данного инфекционного агента (штамма микроба или вируса). • В. зависит как от свойств инфекционного агента, так и от восприимчивости (чувствительности) инфицируемого организма. • О величине В. судят по тяжести вызываемых микробом или вирусом заболеваний, в экспериментах на животных — по смертельной дозе инфекционного агента. • В. определяется не только способностью микроорганизма внедряться в организм восприимчивого животного, размножаться и распространяться в нём, но и тем, что микроб (или вирус) вырабатывает токсины и пр. …. • 5
Восприимчивость • способность организма человека, животных, растений к заболеванию при контакте с болезнетворными агентами биологической природы (вирусами, микробами, простейшими и др. ). В. зависит от видовых и индивидуальных особенностей организма, его состояния, а так же от болезнетворности (вирулентности, патогенности) микроорганизма. 6
• Вся информация о признаках, присущих организму, сосредоточена в его генетическом аппарате. Он обеспечивает сохранение и воспроизведение этих признаков в процессе размножения организма, так как возникающие дочерние особи обнаруживают в большинстве случаев полное сходство с родительскими формами. 7
• Это говорит о том, что генетический аппарат обладает высокой стабильностью и точностью механизмов, обеспечивающих его функционирование. Однако стабильность генетического аппарата не абсолютна, так как это исключало бы всякую возможность его изменений и, следовательно, эволюционных преобразований, приведших в конечном итоге к возникновению разнообразных форм жизни, свидетелями (и 8 представителями) которых мы являемся.
• Таким образом, генетический аппарат должен быть организован так, чтобы, с одной стороны, обеспечивать свою стабильность, с другой — быть достаточно пластичным, т. е. обладать способностью к изменчивости. 9
колонизация • К основным факторам патогенности (вирулентности) относят способность микроорганизмов к колонизации, их устойчивость к разным микробицидным факторам организма, свойства инвазивности и токсигенности, а также способность к длительному персистированию. Способность к колонизации. Адгезия. Факторы колонизации. 10
колонизация • Размножению бактерий в первичном очаге инфицирования предшествует адгезия [от лат. adhaesio, прикрепляться к чему-либо], то есть закрепление бактерий на поверхности клеток, что, собственно, и служит началом инфекционного процесса. • Прикрепление к поверхности клеток (например, к эпителию слизистых оболочек) обеспечивают адгезины, или факторы колонизации — различные микробные продукты — молекулы адгезии (белки, ЛПС, липо-тейхоевые кислоты). Молекулы адгезии могут располагаться непосредственно на поверхности бактериальной клетки либо входить в состав микроворсинок или капсул. 11
• колонизация Специфические взаимодействия. На поверхности бактерий имеются молекулы, способные к стереоспецифичному связыванию с комплементарными молекулами на мембранах эукарио-тических клеток (например, гемагглютинины или тейхоевые кислоты). Другие механизмы колонизации. Некоторые бактерии способны «заранее подготавливать» место для дальнейшего размножения; например, нейраминидаза облегчает проникновение холерного вибриона через слой слизи и контакт с сиалосодержащими рецепторами эпителия кишечника. Микроорганизмы также способны сорбироваться на бактериях, уже колонизировавших поверхность слизистых оболочек, либо связывать белки (например, фибронектин), рецепторы к которому имеются на многих клетках макроорганизма. 12
Токсинообразование • Бактериальные токсины условно разделяют на экзотоксины и эндотоксины. • По мишени действия токсины разделяют на • Гематические яды (Heamotoxic) — яды, затрагивающие кровь. • Нейротоксины (Neurotoxic) — яды, поражающие нервную систему и мозг. 13
Токсинообразование • Гемотоксины (Haemorrhaginstoxins) — токсины, которые повреждают кровеносные сосуды и вызывают кровотечение. • Гемолитические токсины (Haemolysinstoxins) — токсины, которые повреждают эритроциты. • Нефротоксины (Nephrotoxins) — токсины, которые повреждают почки. • Кардиотоксины (Cardiotoxins) — токсины, которые повреждают сердце. • Некротоксины (Necrotoxins) — токсины, которые разрушают ткани, вызываяя их омертвление (некроз) 14
Значение установление механизмов передачи патогенных свойств и устойчивости к лекарственным препаратам Молекулярная биология – изучает фундаментальные основы органической жизни Молекулярная генетика это генетика бактерий и бактериофагов. 1865 – Г. Мендель: существование дискретных единиц наследственности генов 1869 Ф. Мишер впервые выделил ДНК 1928 Ф. Гриффитс осуществил трансформацию 1953 Ф. Крик и Дж. Уотсон определили структуру гена Ген – структурная единица ДНК, расположение кодонов в которой определяет первичную структуру полипептидной цепи (белка). Три фундаментальных функции гена: непрерывность наследственности благодаря механизму репликации ДНК. управление структурами и функциями организма с помощью генетичекого кода из четырех оснований: А (аденин), Т (тимин), Г (гуанин), Ц (цитозин). эволюция организма благодаря мутациям и генетическим рекомбинациям. Этапы эволюции генетической системы: кодон ген оперон геном вирусов и плазмид хромосома прокариот (нуклеоид) хромосома эукариот (ядро). 15
Генетический аппарат бактерий. Генетический контроль факторов вирулентности. • Генетический материал бактерий представлен ДНК, которая входит в состав ядерной структуры – нуклеоида (хромосомная ДНК) и внехромосомными генетическими элементами (плазмиды, мобильные генетические элементы – транспозоны, вставочные или IS (insertion sequence) – элементы, острова вирулентности). • У бактерий одна замкнутая кольцевидной формы хромосома, которая может содержать до нескольких тысяч отдельных генов. Вегетативная репликация хромосомной и плазмидной ДНК обусловливает передачу генетической информации по вертикали – от родительской клетки к дочерней. Передача генетической информации по горизонтали (генетические рекомбинации) осуществляется различными механизмами – в результате коъюгации (при непосредственном контакте клеток, при участии tra – оперона, конъюгативных F – плазмид), трансдукции (при переносе генетической информации вирусами бактерий), трансформации (при захвате и поглощении фрагментов чужой ДНК и образовании на этой основе рекомбинанта) и др. 16
Особенности репликации бактерий: вегетативная передача по вертикале контролируется хромосомой и плазмидой коньюгативная контролируется только плазмидными генами. репаративная устранение из ДНК структурных повреждений, контролируется хромосомой и плазмидой 17
Плазмиды • Плазмиды экстрахромосомный генетический материал (ДНК), более просто устроенные по сравнению с вирусами организмы, наделяющие бактерии дополнительными полезными свойствами. По молекулярной массе плазмиды значительно меньше хромосомной ДНК, содержат от 40 до 50 генов. • Их объединение в одно царство жизни с вирусами связано с наличием ряда общих свойств- отсутствием собственных систем мобилизации энергии и синтеза белка, саморепликацией генома, абсолютным внутриклеточным паразитизмом. 18
Схема 19
Переход плазмиды в автономное состояние связаны с индуцирующими воздействиями внешней среды. Продукты плазмидных генов могут способствовать выживанию бактерий (селективное преимущество). Самостоятельная репликация плазмидной ДНК способствует ее сохранению и распространению в потомстве. Встраивание плазмид и профагов происходит только в гомологичные участки ДНК. IS последовательностей и транспозонов встраиваются в любой участок ДНК. Виды плазмид. Описано свыше двух десятков плазмид: F плазмида (половой фактор) циркулярно замкнутую нить ДНК с мол. массой 60 • 106. Контролирует синтез половых ворсинок (sex или F-pili) способствуют конъюгации (спариванию бактерий доноров с реципиентными клетками) Перенос генетического материала (ДНК) детерминируется tra опероном F плазмиды (от англ. Transfer перенос). F плазмиду можно удалить (элиминировать) из клетки, обработав ее акридиновым оранжевым. Располагается в цитоплазме и может встраиваться в хромосому. 20
R плазмиды определяют устойчивость бактерий к лекарственным препаратам и чрезвычайно осложняют химиотерапию. Они имеют сложное молекулярное строение и включают: r ген, который содержит более мелкие мигрирующие элементы ISпоследовательности, транспозоны и tra опероны. r ген контролирует синтез фермента, вызывающего инактивацию или модификацию антибиотика. Многие r гены является транспозонами и перемещаются от плазмиды носителя в другие репликоны. В r гене может содержаться несколько транспозонов, контролирующих устойчивость к разным антибиотикам. Tra-оперон обеспечивает конъюгативность плазмиды, входит в состав R пламид грамотрицательных бактерий. Грам положительные бактерии содержат в основном неконъюгативные плазмиды, которые передаются путем трансдукции. 21
Плазмиды патогенности (tox плазмиды) контролируют вирулентные свойства бактерий и токсинообразование. Бактериоциногенные плазмиды контролируют синтез бактериоцинов, антибактериальных веществ способных вызывать гибель бактерий того же или близких видов. Бактериоцины обнаружены у кишечных бактерий (Co. L-плазмиды, колицины), бактерий чумы (пестицины), холерных вибрионов (вибриоцины), стафилококков (стафилоцины). Колицины – это вещества белковой природы более 25 типов, которые различаются по: физико химическим, антигенным свойствам, способности адсорбироваться на определенных рецепторах бактерий. Обозначаются латинскими буквами А, В, С, D, Е 1, Е 2, К и т. д. Бактерии несущие Co. L плазмиды резистентны к действию гомологического колицина. Механизм бактерицидного действия колицинов: после адсорбции на рецепторах наружной мембраны бактерий один из колицинов (ЕЗ) нарушает функцию рибосом, другой (Е 2) является ферментом эндодезоксирибонуклеазой. Колицины действуют и на цитоплазматическую мембрану бактерий. 22
Col плазмиды находятся в автономном состоянии и передаются при конъюгации без сцепления с хромосомой. Col. V, Col. B могут встраиваться в бактериальную хромосому (интегрированное состояние). Как и F плазмиды, передаются путем конъюгации благодаря имеющемуся у них trа оперона. Колицины могут губительно действовать на патогенные энтеробактерии, способствуя нормализации микробиоценоза. Определение типа колицинов используется для типирования бактерий при эпиданализе заболеваний, определения типа Col плазмиды (колициногенотипирование), колицина патогенных бактерий (колицинотипирование) контактирующих от больных, из окружающей среды. Плазмиды биодеградации несут информацию об утилизации некоторых органических соединений источников углевода и энергии (лактоза, сахароза, раффиноза) и образовании протеолитических ферментов. Обеспечивают хозяину селективные преимущества в объектах окружающей среды и в организме человека. Например, урологические штаммы кишечных палочек содержат плазмиду гидролизации мочевины. 23
Внехромосомные факторы наследственности Плазмиды: автономные интегрированные Плазмиды выполняют функции: регуляторную и кодирующую. Регуляторная состоит в компенсации нарушений метаболизма ДНК клетки хозяина. Например, поврежденный бактериальный геном, не способный к репликации, функционально восстанавливается за счет плазмидного репликона. Кодирующая состоит во внесении новой информации, бактерии приобретают новый признак: образованию пилей (F плазмида), резистентности к антибиотикам (R плазмида), выделению бактериоцинов (col плазмида). 24
Мобильные генетические элементы • Основные типы мобильных элементов • Инсерционные (IS) – инсерционные элементы • Интегроны • ISCR элементы • Основная роль : • формировании и распространении резистентности, посредством переноса генов рез-ти , контроль экспрессии генов. 25
Транспозоны несут генетическую информацию, необходимую для транспозиции (нуклеотидные последовательности включающие от 2000 до 20 500 пар нуклеотидов). Способны к самостоятельному премещению и переносу участков внутри генома. При включении в бактериальную ДНК они вызывают дупликации, а при перемещении делеции и инверсии. Находиться в свободном состоянии в виде кольцевой молекулы, неспособной к репликации. Она реплицируется только в составе бактериальной хромосомы. Могут мигрировать в некоторые плазмиды и ДНК фагов, которые, 26 проникая в бактериальные клетки, способствуют их распространению в популяции.
Важнейшим свойством транспозонов является их способность к перемещению с одного репликона (хромосомная ДНК) на другой (плазмида) и наоборот. Выполняют регуляторную и кодирующую функции. Могут нести информацию: для синтеза бактериальных токсинов: ферментов, разрушающих или модифицирующих антибиотики. Транспозоны имеют особые концевые структуры нескольких типов, которые являются маркерами, позволяющими отличать их от других фрагментов ДНК. Их обнаруживают не только у бактерий и дрожжей, но и в клетках растений, насекомых, позвоночных животных и человека. При интеграции транспозонов в хромосому клеток животных или человека они приобретают удивительное сходство с провирусами, находящимися в составе их хромосом. 27
ls-последовательности От (англ. Insertion вставка, sequence последовательность) представляют собой транспозируемые элементы, которые также называются «вставки последовательностей оснований» . Это фрагменты ДНК длиной 1000 пар нуклеотидов и более. В Is-последовательностях содержится информация, необходимая только для их транспозиции, т. е. перемещения в различные участки ДНК. Вследствие такого рода перемещений Is-последовательности могут выполнять ряд функций. 1. Координировать взаимодействие транспозонов, плазмид и умеренных фагов как между собой, так и с хромосомой бактериальной клетки и обеспечивать их рекомбинацию. 2. Вызывать инактивацию гена, в которой произошла интеграция ls-последовательности ( «выключение» гена), либо, будучи встроенными в определенном положении в бактериальную хромосому, служить промотором (участками ДНК, регулирующих экспрессию подлежащих структурных генов бактерий реципиен тов), который включает или выключает транскрипцию соответствующих генов, выполняя регуляторную функцию. 28
Вероятность, размер и локализация геномных перестроек зависят от распределения в геномах повторяющихся последовательностей (включая IS-элементы). Установлено, что не только локализация, но и само присутствие IS-элементов в геномах не случайно. 29
• Таким образом, распределение ISэлементов и повторов в геномах бактерий разных видов не одинаково, не беспорядочно и специфично. Так как повторы являются горячими точками рекомбинационных событий, то характер и частоты геномных перестроек должны определяться особенностями распределения повторов и быть видоспецифичными 30
Интегроны • Интегроны представляют собой сложные генетические элементы, предназначенные для захвата генов и содержащие ген интегразы, сайт интеграции для привносимых фрагментов ДНК и промотор для экспрессии генов. и • Сайт интеграции содержит инвертированные повторы, которые узнаются интегразой. Особенно интересно то, что интегроны очень древние генетические элементы, и хотя чаще всего они захватывают кассеты с генами антибиотикоустойчивости, сами интегроны сформировались задолго до эры применения антибиотиков. • Кроме генов антибиотикоустойчивости кассеты, захватываемые интегронами и суперинтегронами, могут содержать гены, ко • дирующие факторы патогенности , гены метаболизма. • Интегроны - это генетический конструктор бактерий. 31
Структура и работа интегрона. 32
“Острова” патогенности бактерий. • • Под островами патогенности принято понимать фрагменты ДНК, включающие дискретные гены вирулентности и обнаруживаемые только у патогенных микроорганизмов. Указанные фрагменты ДНК отличаются от основного (core) генома), способны распространяться среди одного или родственных видов бактерий путем естественной конъюгации, трансдукцией или трансформацией. Мобильность островов патогенности (размеры от 10 до 200 kb - килобайт) связана с тем, что они могут входить в состав ДНК бактериофагов, транспозонов или плазмид и интегрированы в районах хромосомы вблизи генов), кодирующих специфические т. РНК. Это обеспечивает возможность горизонтального переноса генетической информации. Стабильность островов патогенности различна, поскольку гены вирулентности могут быть включены в состав бактериофага, транспозона или плазмиды. Интеграция, стабилизация и экспрессия генов вирулентности в составе островов патогенности определяет их основные функции - патогенность, метаболизм, лекарственную устойчивость, секреторные функции и др. Известны острова патогенности, несущие гены, контролирующие синтез адгезинов, инвазинов, токсинов (гемолизинов, цитотоксинов, энтеротоксинов, и др. ), усвоение ионов железа, синтез и транспорт эффекторных молекул из бактериальных клеток. 33
Понятие о генотипе и фенотипе. Генотипическая и фенотипическая изменчивость Генотип –совокупность имеющихся у организма генов Фенотип – совокупность реализованных (внешних) генетически детерминированных признаков, т. е. индивидуальное (в определенных условиях) проявление генотипа. Виды изменчивости у бактерий – фенотипическая (модификации) и генотипическая (мутации, рекомбинации). Модификации – временные, адаптивные, наследственно не закрепленные изменения: - морфологические - биохимические Диссоциации стандартные проявления модификации в разделении однородной популяции на два или более типа. S колонии (гладкие) R колонии (шероховатые) признак неблагоприятных условий (S R диссоциация). 34
Генетическая природа изменчивости Приобретение новых генов Единичные точечные мутации Изменчивость микроорганизмов Рекомбинации Множественные мутации 35
Генотипическая изменчивость бактерий: мутации и генетические рекомбинации 1. Мутации скачкообразные изменения , наследственно закрепленные изменения первичной структуры, ошибки копирования : Хромосомные новые признаки, более двух хромосом Генные один ген (вставка, делеция, модификация оснований) А. Спонтанные дикие Б. Индуцированные Химические мутагены повышают частоту до 1 клетка/103 Физические мутагены – R , УФ , рентгеновское излучения 2. Рекомбинации – передача генетического материала по горизонтали между отдельными бактериями – трансформация, трансдукция, конъюгация. 36
Типы мутаций: Модификация оснований изменение отдельных нуклеотидов Вставка – включение дополнительных оснований Делеция – потеря одного или группы оснований Деформация спирали ДНК 37
Рекомбинации – передача генетического материала по горизонтали между отдельными бактериями. А. Транформация – бактерия реципиент захватывает из внешней среды фрагмент чужеродной ДНК в фазу физиологической компетентности (log), когда аутолитические ферменты растворяют клеточную стенку на участке её синтеза (чаще у Грам+) Индуцированная – с очищенной ДНК Спонтанная – в естественных условиях 38
В. Трансдукция – перенос генетического материала от клетки донора клетке реципиенту бактериофагом. Неспецифическая – перенос случайного фрагмента ДНК. Специфическая – перенос строго определенного фрагмента ДНК умеренным фагом. Абортивная фрагмент ДНК не встраивается в генофор реципиента, остается в цитоплазме. 39
В. Конъюгация перенос генетического материала от клетки донора клетке реципиенту при непосредственном контакте с помощью F пилей (конъюгативный мостик – длинные трубчатые структуры белковой природы). Контролируется конъюгативными F плазмидами с tra опероном (transfer перенос) Hfr-клетки – имеют интегрированную в хромосому F плазмиду, обеспечивают высокую частоту рекомбинаций. 40
Биотехнология 41
Репарации Бактерии обладают специальными системами, восстанавливающими повреждения генетического материала репарационных, а сам процесс восстановления клеточного генома (ДНК) — репараций. Это обусловливает относительную стабильность их ДНК. Репарация поврежденной ДНК осуществляется ферментами, образование которых контролируется специальными генами. Функции многочисленных репаративных ферментов заключаются в установлении места повреждения ДНК, его «вырезании» , синтезе поврежденных фрагментов на матрице сохранившейся нити ДНК, ее встраивании в молекулу репарируемой нити ДНК. Одна из систем, восстаналивающая повреждения ДНК, вызванные УФ лучами, названа системой фотореактивации. Ферменты фотореактивации действуют в присутствии видимого света и осуществляют расщепление тиминовых димеров, превращающей их в мономерные формы. Активность другой системы, выполняющей эти же функции, обеспечивается ферментами, действующими в отсутствии видимого света. Это система темновои репарации, которую условно подразделяют на дорепликативную и пострепликативную. Повреждения ДНК, вызванные химическими мутагенами, так же репарируются ферментами бактериальной клетки. 42
Генетика вирусов Вирусы ДНК – геномные и РНК – геномные (позитивные РНК с матричной активностью и негативные, которые должны транскрибироваться в матричные плюс РНК) 43
Схемы репродукции вирусов • 1. Вирионная (матричная)+РНК комплементарная –РНК (в рибосомах) вирионная+РНК. • 2. Вирионная негативная (-) РНК информационная (матричная)+РНК вирионная РНК (на геноме клетки хозяина). • 3. Однонитевая ДНК -ДНК +ДНК. • 4. Ретровирусная РНК ДНК копия (провирус) РНК. • 5. Двунитевая ДНК разделение нитей формирование на каждой комплементарной нити ДНК. 44
Репродукция плюс однонитевых РНК вирусов Пикорнавирусы, флавивирусы, тогавирусы у них геномная плюс нить РНК выполняет функцию и. РНК. Вирус (1), после эндоцитоза, освобождает в цитоплазме (2) геномную плюс РНК, которая как и. РНК связывается с рибосомами (3): транслируется полипротеин (4), который расщепляется на 4 структурных белка (NSP 1 4), включая РНК зависимую РНК полимеразу. Эта полимераза транскрибирует геномную плюс. РНК в минус нить РНК (матрицу), на которой (5) синтезируются копии РНК двух размеров: полная плюс нить 49 S геномной РНК; неполная нить 26 S и. РНК, кодирующая С белок капсида (6) и гликопротеины оболочки El З. Гликопротеины синтезируются на рибосомах, связанных с мембранами эндоплазматического ретикулума, затем включаются в мембрану и гликозилируются. Дополнительно гликозилируясь в аппарате Гольджи (7), они встраиваются в плазмалемму. С белок образует с геномной РНК 45 нуклеокапсид, который взаимодействует с модифицированной плазмалеммой (8). Вирусы выходят из клетки почкованием (9).
ОСНОВЫ ПОПУЛЯЦИОННОЙ ГЕНЕТИКИ В организме человека бактерии находятся в виде популяций, локализующихся в определенных биотопах (полость рта, просвет кишки). Стабильность и выживаемость бактериальной популяции определяются ее генофондом, т. е. совокупностью генотипов всех составляющих ее микробных клеток. В процессе жизнедеятельности микробной популяции в ней появляются особи с измененными признаками, которые являются гетерогенными по отношению к большинству клеток. Чем выше гетерогенность популяции, тем больше шансов на ее выживание. По мере накопления гетерогенных особей, имеющих селективные преимущества перед исходными клетками, изменяется генофонд популяции. Изменчивость генофонда микробной популяции может быть подразделена на два типа: фенотипическую — модификационную генотипическую — мутационно рекомбинационную. Модификационныи тип осуществляется с помощью постоянно действующих механизмов репрессии и индукции структурных генов, не сопровождающихся их перестройкой. Мутационно рекомбинационный механизм связан с образованием в микробной популяции измененных генотипов, постоянно возникающих в результате мутаций, рекомбинаций, внесения внешней информации с транспозируемыми элементами. 46
Скачать презентацию Лекция Патогенность и вирулентность Генетика бактерий и вирусов
лек 6 Патогенность и Генетика Темникова.ppt