Лекция 8 Транскрипция у эукариотов Три РНК-полимеразы сложнее

Лекция 8. Транскрипция у эукариотов Три РНК-полимеразы: сложнее, чем у E. coli; ~10 полипептидных цепей; у E. coli РНК-pol присоединяется к ДНК, у эукариотов нужны дополнительные факторы. Любая РНК-pol состоит из 2 больших субъединиц (120 -220 к. Да) и от 5 до 13 малых субъединиц. Большие субъединицы являются аналогами больших субъединиц β и β’ прокариот. РНК-pol I – 14 субъединиц, 40 000 молекул, не чувствительна к α-аманитину (яд бледной паганки Amanita phaloides), синтезирует высокомолекулярный предшественник больших р. РНК (18 S, 5. 8 S и 28 S) в ядрышке. РНК-pol II – 12 субъединиц, 40 000 молекул, чувствительна к α-аманитину, отвечает за синтез всех белков (м. РНК), большую часть генов малой ядерной РНК (мя. РНК), гены микро. РНК (ми. РНК). РНК-pol III – 17 субъединиц, 20 000 молекул, умеренно чувствительна к α-аманитину, синтезирует гены транспортных РНК (т. РНК), р. РНК 5 S, малой ядрышковой РНК (мяк. РНК), внутриклеточного транспорта (7 SL РНК), а также участвующие в посттранскрипционном процессинге м. РНК (U 6 РНК).

Унифицированная номенклатура субъединиц РНК-полимеразы I Группа субъединиц Субъединицы S. cerevisiae Гомозиготные субъединицы других эукариот RPA 190 (RPA 1) RPA 135 (RPA 2) Rpa 1 Rpa 2 Общие субъединицы РНК-полимераз I и III RPC 40 RPC 19 Rpc 40 Rpc 19 Общие субъединицы РНК-полимераз I, II и III RPB 5 RPB 6 RPB 8 RPB 10 RPC 10 Rpb 5 Rpb 6 Rpb 8 Rpb 10 Rpc 10 Малые специфические субъединицы RPA 49 RPA 43 RPA 34 RPA 12 Rpa 49 Rpa 43 Rpa 34 Rpa 12 Большие (каталитические) субъединицы

Промоторы РНК-полимеразы I: Базальный промотор (-45 - +20); Вышележащий элемент управления (ВЭУ), расположен ~ 100 пн левее. Промоторы РНК-полимеразы II: - Базальный промотор состоит из двух главных сегментов: блока -25, или ТАТА-блока (5’TATAWAAR-3’, где W – A или T, R – A или G), и инициаторной последовательности (5’-YCANTYY-3’, где Y – C или T, а N – любой нуклеотид), расположенных вокруг нуклеотида +1; Нижележащий промоторный элемент (НПЭ) (+28 - +32), сайт связывания TFIID; Обогащенный GC мотив (7 пн), примыкающий сверху к ТАТА-блоку, который опознается комплексом TFIIB; Проксимальный элемент (-45 - -60) выше тех генов мя. РНК, которые транскрибируются РНКполимеразой II. Промоторы РНК-полимеразы III: Последовательности расположены в пределах гена, охватывают 50 -100 пн и включают два консервативных блока, разделенных изменчивой областью; Другого типа, подобны промоторам РНК-полимеразы II, имеют ТАТА-блок и веер дополнительных промоторных элементов.

Структура промоторов у эукариотов Синим заштрихованы последовательности ДНК, необходимые для функционирования промоторов. за 25 нуклеотидов до начала транскрипции ТАТА-box Т 85 А 97 Т 93 А 85 А/Т 83 TF (transcription factor) I, III – РНК-полимеразы I, III А, В, С, … - по мере открытия факторов РНК-полимеразы не способны самостоятельно начинать транскрипцию с промоторов. Для базальной (не регулируемой промотор-специфичными белками-регуляторами) транскрипции требуется набор белковых факторов GTF (General Transcription Factors). Для РНК-pol II (513 к. Да) насчитывают не менее 25 GTFs с общей массой 1500 к. Да. Для регулируемой инициации транскрипции РНК-pol II с индивидуальных промоторов, кроме специфических белков-активаторов и GTFs, необходим медиатор, содержащий 20 субъединиц (~1000 к. Да). Поскольку медиатор обнаружен в специфическом комплексе с РНК-pol II, этот комплекс назван холоферментом. Хотя в отличие от бактериального холофермента, он не способен к базальной инициации транскрипции.

Модель сборки предынициаторного комплекса РНК-полимеразы II в области ТАТА-box эукариотического промотора TFIID (transcription factor for polymerase II, fraction D) включает ТВР (TATA-binding protein) субъединицу, связывающуюся с ТАТА-box, и остальные 12, обозначенные как TAFs (TBP-associated factors) и содействующие прикреплению ТВР к ТАТА-боксу. TFIID образует площадку для посадки TFIIB. TFIIA стабилизирует прикрепление ТВР и TAFs. TFIIB посредник в привлечении РНК-полимеразы II, влияет на выбор точки начала транскрипции. TFIIF связывает РНК-pol II с ДНК (-19, -5), взаимодействует с нематричной нитью, участвует в плавлении промотора выше участка инициации. Гетеротетрамер α 2β 2 (74 и 30 к. Да, RAP 74 и RAP 30). TFIIE – посредник в привлечении TFIIH, опосредует различные действия TFIIH – 9 субъединиц, 3 из которых проявляют энзиматическую активность (единственный GTF, имеющий энзиматичекую активность). Действие геликазы, обуславливающее переход промоторного комплекса из закрытой в открытую форму; возможно, влияет на разрешающий отступ промотора посредством фосфорилирования С-концевого домена наибольшей субъединицы РНК-полимеразы II. 3 GTFs взаимодействуют с ДНК (TBP/TFIID, TFIIA и TFIIB). Это обеспечивает платформу для связывания с РНК-pol II с присоединенным к ней TFIIF. Затем присоединяется следующая пара TFIIE и TFIIH и переводят РНК-pol II в активное состояние.

Структура предыиниаторного комплекса В результате прикрепления ТВР к ТАТА-блоку формируется площадка, на которой может быть собран комплекс инициации. Присоединение ТВР вызывает формирование в ДНК изгиба ~80 о. Изгиб в ДНК открывает малую бороздку в области ТАТА-блоком, облегчая прикрепление TFII. Это присоединение вовлекает контакты с ТАТА-блоком через расширенную малую бороздку и через большую бороздку, при этом распознающий мотив TFIIB располагается непосредственно выше ТАТАблока. В результате этих прикреплений обеспечивается правильное расположение (относительно сайта инициации транскрипции) РНК-полимеразы II, которая привносится в комплекс фактором TFIIF. Предынициаторный комплекс завершается добавлением в него факторов TFIIE и TFIIH, последний из которых обладает действием геликазы и, как думают, разрушает пары оснований в ДНК, а следовательно, переводит промотор в открытую форму.

Инициация транскрипции РНК-полимеразой I РНК-рol I присутствует в клетке в избыточном количестве, а лимитирующей стадией, по-видимому, является образование стабильного предынициаторного комплекса на промоторе. Нуклеотидные последовательности промоторных областей у различных организмов различаются. Однако положение и организация регуляторных элементов практически одинаковы. Промоторы состоят из 2 х элементов: корового промотора СР (core promotor) и расположенного выше дополнительного элемента UE (upstream element). Между ними нейтральная спейсерная последовательность, длина которой строго фиксирована. У всех эукариот СР на 2 -10 пн перекрывает точку начала транскрипции, а внешняя граница UE удалена от нее на ~150 пн. СР достаточен, но присутствие UE значительно стимулирует транскрипцию. С каждым участком промотора взаимодействует свой белковый комплекс. S. cerevisiae: с СР взаимодействует CF (core factor), который состоит из 3 полипептидов (RRN 6, RRN 7 и RRN 1). Этот комплекс взаимодействует с РНК-pol I и определяет точку начала транскрипции. С UE взаимодействует мультибелковый комплекс UAF (upstream activating factor), состоящий из полипептидов RRN 5, RRN 9 и RRN 10 и гистоновых белков Н 3 и Н 4. CF+RRN 3 достаточно для базального уровня транскрипции. Однако CF слабо взаимодействует с СР и не способен обеспечить эффективный синтез р. РНК. CF+RRN 3+UAF+TBP обеспечивает высокоэффективную транскрипцию р. РНК. ТВР не относится к компонентам базальной транскрипции, а лишь является связующим звеном между UAF и CF. RRN 3 взаимодействует с РНК-pol I и играет важную роль на стадии отделения РНК-pol I от промотора.

У позвоночных имеется гомолог CF – SL 1 (selective factor 1), состоящий из TBP и трех белков TAFs (TBP-associated factors): TAFI 110, TAFI 63, TAFI 48 у человека (у мыши – родственный комплекс TIF -IB). Белок UBF (upstream binding factor) существует в двух формах, UBF 1 (97 k. D) и UBF 2 (95 k. D), образующие димер. Кодируются одним геном, две формы образуются в результате альтернативного сплайсинга одной м. РНК. UBF узнает элементы вторичной структуры, а не специфические последовательности, взаимодействует и с базальным, и с вышележащим элементом. SL 1 вместе с UBF направляет РНК-pol I и два комплекса TIFIA и TIFIC, к промотору. Обнаружен гомолог дрожжевого белка RRN 3 – у мыши TIF-IA и человека (мономер 75 к. Да), необходимый на стадии инициации и отделяющийся от РНК-pol I в процессе элонгации. У мыши выделен фактор TIF-IC, необходимый в момент отделения РНК-pol I от инициирующего комплекса. РНК-pol I связывает четыре белковых комплекса перед опознанием промотора, и такая полноценная конструкция прикрепляется к ДНК за один прием. Факторы инициации РНК-полимеразы I Saccharomyces cerevisiae CF RRN 6 RRN 7 RRN 11 RRN 3 TBP UAF RRN 5 RRN 9 RRN 10 Не обнаружен Не изучен Schizosaccharomyces pombe Не изучен Rrn 3 TBP (Tdf 1) Не изучен Rrn 5 Не обнаружен Не изучен Homo sapiens Mus musculus SL 1 TAFI 110 TAFI 63 TAFI 48 h. Rrn 3 (TIF-IA) h. TBP Не изучен TIF-IB TAFI 95 TAFI 68 TAFI 48 TIF-IA m. TBP Не изучен h. UBF Не изучен m. UBF TIF-IC ТВР вовлечен в инициацию транскрипции для всех трех РНК-полимераз.

Инициация транскрипции РНК-полимеразы III - Промоторы изменчивы по структуре. - Разнообразные процессы их опознавания. - Требуются различные наборы GTFs. - В процессах инициации всех типов участвует TFIIIB, одной из субъединиц которого является ТВР. - В случае промоторов типа мя. РНК U 6, содержащих ТАТА-блок, ТВР напрямую связывается с ДНК. - Для промоторов, локализованных внутри генов и не имеющих ТАТА-блока, закрепление ТВР осуществляется через пару факторов сборки, названных TFIIA и TFIIIC. Эти белки необходимы только для прикрепления ТВР к промотору и не нужны для последующего приземления РНК-полимеразы III.

Элонгация транскрипции РНК-полимеразой II Активация инициаторного комплекса требует присоединения фосфатных групп к С-концевому домену наибольшей субъединицы РНК-полимеразы II. С-конец большой субъединицы РНК-pol II имеет специальный домен CTD (carboxyl-terminal domain). Он состоит из 7 АК (-Tyr-Ser-Pro-Thr-Ser-Pro-Ser-)n повторяющихся много раз (у млекопитающих 52 повтора). В процессе инициации транскрипции CTD фосфорилируется по Ser киназой TFIIH, что вызывает существенное изменение в ионных свойствах полимеразы и является сигналом для освобождения от GTFs и промотора и позволяет РНК-pol II покинуть предынициаторный комплекс и сдвинуться по ДНК-матрице. По отбытии полимеразы некоторые из GTFs отделяются от базального промотора, но TFIID, TFIIA и TFIIH остаются на нем, что позволяет осуществлять повторную инициацию без необходимости восстановления полной сборки с самого начала, т. е. более быстрый процесс.

Очистка промотора и уход от промотора Фосфорилирование С-конца не сопровождается незамедлительным началом элонгации. Можно выделить два этапа – очистку промотора, переход от предынициаторного комплекса к комплексу, начавшему синтезировать РНК, и уход от промотора, в ходе которого полимераза отодвигается от промоторой области и предается синтезу транскрипта. Уход от промотора – важная контрольная точка, существует выбор между продуктивным синтезом и прерыванием, когда транскрипт достигнет размера ~ 30 н успешный уход от промотора может быть связан с кэпированием. Ферменты кэпирования являются компонентами РНК-полимеразы II. РНК-полимераза II синтезирует длинные м. РНК (например пре-м. РНК гена дистрофина человека ~2400 тпн, синтезируется 20 ч). Скорость синтеза РНК-полимеразы II – до 2000 н/мин. Очищенная РНК-полимераза II – 300 н/мин. Факторы элонгации придают полимеразе устойчивость, сокращается число пауз и остановок. В клетках человека известно ~ 30 факторов элонгации. SII и ELL – два из многочисленных факторов элонгации, которые, по-видимому, ассоциируют с РНК-pol II при ее движении вдоль ДНК. В процессе элонгации РНК-pol II является составной частью гигантского комплекса, состоящего из ~50 компонент ( М > 3000 к. Да). Фактор элонгации TFIIF, CSB, ELL, Elongation TFIIS FACT Функции Подавляют паузы в областях где могут образовываться внутригенные шпильки Предотвращает полную остановку элонгации Модифицирует хроматин

Терминация транскрипции для РНК-полимеразы I Saccharomyces cerevisiae mouse Терминация происходит на некотором расстоянии перед сайтом терминации. Сайт терминации отвечает как за терминацию, так и за реинициацию транскрипции. Терминатор для РНК-pol. I имеет 2 элемента: - сайт связывания белка терминации, важна его ориентация, терминация осуществляется за 12 -20 н до этого элемента; - upstream element длиной 10 -12 н, 3’-конец пре-м. РНК Т-богатый в некодирующей нити (если А-, С- или Gбогатый, то РНК вовсе не освободится). С терминатором связывается белок у S. cerevisiae – Reb 1 p, у мыши – TTFI. В С-конце располагается Myb-мотив (~ 80 АК), отвечающий за связывание с ДНК. Белок PTRF (фактор высвобождения полимеразы I и транскрипта) вызывает отсоединение полимеразы и транскрипта от матрицы ДНК. В отличие от прокариотов ρ-независимый, отсутствует инвертированный повтор.

Повторное соскальзывание РНК-pol I встречает poly. A, следует «пауза» . Связь U-A слабая, РНК проскакивает. Если последовательность poly. A идеальная, то образуется 8 пн гетеродуплекса РНК-ДНК. Соскакивает на 2 н и опять происходит транскрипция и так до бесконечности может присоединять U. Модель терминации РНК-pol. I встречает Reb 1 p и останавливается, следует «пауза» . Неидеальная последовательность poly. A вызывает проскок при котором образуются неспаренные основания, которые и высвобождают РНК. Существуют дополнительные факторы, помогающие высвобождению РНК. Паузы регулируются афинностью ДНК-связывающего белка Reb 1 p, а эффективность высвобождения – UE-последовательностью. Reb 1 p также способствует высвобождению РНК. Плотность РНК-pol I в активных Rs-генах – 1/100 пн Скорость элонгации - ~ 20 н/сек, to комн. Инициация и терминация осуществляются – 1/5 сек in vivo

Связь между полиаденилированием и терминацией транскрипции РНК-полимеразы II У млекопитающих CPSF взаимодействует с TFIID и привлекается в комплекс полимеразы во время стадии инициации транскрипции. Двигаясь по матрице на РНК-полимеразе II, CPSF способен связаться с сигнальной последовательностью поли-А, Как только она будет транскрибирована, и запустить реакцию полиаденилирования (во время полиаденилирования белок может поддерживать контакт с РНК-полимеразой II). Это изменяет взаимодействие между CPSF, Cst. F и С-концевым доменом РНК-полимеразы II, так что терминация теперь предпочтительна по сравнению с продолжающейся элонгацией.