Лекция 8 РНК-редактирование Понятие о РНК-редактировании Редактирование митохондриальной

Лекция 8. РНК-редактирование Понятие о РНК-редактировании Редактирование митохондриальной м. РНК кинетопластных простейших Эдитинг митохондриальной м. РНК плесневого гриба Physarum polycephalum Эдитинг митохондриальных м. РНК растений Редактирование структурных РНК Эдитинг хлоропластных м. РНК растений Происхождение и эволюция РНК-редактирования

Этапы крушения центральной догмы молекулярной генетики ДНК и. РНК ДНК БЕЛОК и. РНК БЕЛОК 50 -60 -ые гг 70 -ые гг Обратная транскрипция ДНК Сплайсинг, процессинг пре и. РНК РНКэдитинг 80 -ые гг. БЕЛОК 90 -ые гг. (1986)

В 1986 году изменения последовательностей информационной РНК (м. РНК), ведущие к модификации ДНК-кодируемой информации, были обнаружены в митохондриях паразитических простейших – трипаносом В м. РНК наблюдались вставки или (реже) делеции уридиновых нуклеотидов Эти вставки приводили к изменению информационного контекста по сравнению с закодированным в ДНК-молекуле Такая "правка" ДНК матриц на уровне м. РНК получила название РНК-редактирование (RNA-editing)

Митохондриальная ДНК трипаносом и других кинетопластных простейших, называемая кинетопластной ДНК, состоит из комплекса больших и малых колец Приблизительно 50 сцепленных максиколец размером 23 -36 тпн содержат структурные и р. РНК гены и несколько специальных генов РНК-проводников (guide -РНК) От 5 до 10000 сцепленных миниколец кодируют все остальные guide-РНК. Количество различных генов РНК-проводников в клетках видоспецифично, их бывает до 300.

Из 20 генов мт. ДНК трипаносом 12 редактируются

РНК-проводники являются комплементарными – "антисмысловыми" к участкам редактируемых м. РНК Они способны образовывать короткие "якорные" дуплексы с пре-редактируемой РНК вблизи участка эдитинга

Вставки и делеции уридиновых (U) нуклеотидов, обычно в кодирующие районы m. RNA транскриптов митохондриального генома трипаносом

м. РНК перед эдитингом 5' 4 321 AAA (N) 3' GCGGAGAAAAAAGGGUCUUUUAAUG : : : 3‘ UUUUU CAGAAAAUUAC 5' РНКOH U A проводник U C (quide R NA) A A Поли-U C U Якорь конец U A U U ЭДИТИНГ Отредактированная м. РНК 5' 4 3 2 1 GCGGAGAAAAAAUGUGUUGUCUUUUAAUG : 3' UUUUUUUACUUUAUACAACAGAAAAUUAC 5' AAA 3' Guide RNA OH Предполагаемая структура РНК-проводника (guide RNA), гибридизирующегося с пре-редактированной и редактированной м. РНК Последовательность g. RNA между двумя дуплексами определяет эдитинг в сайтах с 1 по 4. Эдитинг закончен, когда достигается полная гибридизация между молекулами

Редактирование митохондриальных транскриптов миксомицета Physarum polycephalum Myxomycota – древние эукариоты, одни из первых «обладателей» митохондрий Всего в митохондриальных РНК Physarum обнаружено около точек эдитинга, причем они располагаются не только в белоккодирующих матрицах, но и в р. РНК, и в т. РНК. 1000

Редактирование Physarum происходит в основном путем инсерций цитидина. В одной молекуле м. РНК α-АТФазы было обнаружено 54 некодированных цитидинов. Обнаружены также инсерции динуклеотидов: GC, GU, CU, AU , AA Вставки наблюдаются в среднем через каждые 15 -35 нуклеотидов, в р. РНК – через ~45 нуклеотидов От 9 до 64 нуклеотидов встраиваются в м. РНК матрицы Physarum

Редактирование у миксомицетов каким-то образом связано с транскрипцией Инсерции м. РНК происходят по позициям, находящимся на расстоянии не далее 14 -22 нуклеотидов от сайта, который в это время транскрибируется (а возможно и гораздо ближе) ? ? ? Механизмы узнавания сайтов и биохимические процессы эдитинга у Physarum пока неясны. В плазмидах, содержащихся в митохондриях Physarum, сайты эдитинга не обнаруживаются, что свидетельствует об ином происхождении плазмид

Редактирование митохондриальных м. РНК растений было обнаружено одновременно в трех лабораториях CGG в универсальном генетическом коде определяет аргинин В митохондриальных генах растений CGG Почему? триптофан Неуниверсальность генетического кода в митохондриях растений? Загадка разрешилась после секвенирования к. ДНК этих генов: во многих сайтах м. РНК были обнаружены C – U замены

Ген Сайты эдитинга белок-кодирующих областей митохондриальных транскриптов пшеницы С-U замены % модифицир. цировано 1000 п. н. аминокислот К-во сайтов эд. / Модифи 17 17, 4 14 4, 3 nad 2 36 24, 5 28 6, 5 nad 3 21 59, 3 22 13, 5 nad 4 23 15, 5 22 4, 5 nad 5 11 5, 5 10 1, 5 nad 6 15 23, 4 9 3, 6 nad 7 32 27, 1 27 6, 9 nad 9 14 24, 3 12 6, 2 atp 9 Оказалось, что эдитингу подвергаются все гены, кодируемые митохондриальной ДНК растений, причем по множеству сайтов nad 1 8 33, 3 5 6, 8 cob 18 41, 3 17 4, 3 cox 2 17 21, 8 15 5, 8 cox 3 12 15, 1 12 4, 5 rps 1 4 7, 8 4 2, 3 rps 2 7 6, 4 7 1, 9 rps 12 6 16 6 4, 8 orf 156 4 8, 5 3 1, 9 orf 206 42 67, 9 32 15, 5 orf 240 43 59, 7 33 13, 8

Распределение сайтов эдитинга может быть весьма гетерогенным – даже в различных экзонах одного и того же гена Сайты эдитинга в транскриптах некоторых митохондриально кодируемых субъединиц Комплекса 1 у пшеницы nad 4 nad 5 Каждая стрелка соответствует одному сайту эдитинга

У некоторых видов выявлено более 400 точек C – U конверсий митохондриальной м. РНК только в четырех случаях обнаружены обратные превращения U – C: в м. РНК генов cox 3 пшеницы cox 2 гороха и энотеры cob энотеры

C–U превращения, чаще всего происходящие при эдитинге, могут значительно изменить рамки считывания Описаны случаи • • появления новых рамок считывания: (ACG) тре (AUG), мет образования стоп-кодонов: глу CAA UAA глу CAG UAG арг • C–U CGA UGA Обрывание рамки считывания (U–C эдитинг у Ceratophyllum наоборот, аннулирует стоп-кодоны) • изменение аминокислотных последовательностей белков Идентификация точек эдитинга в какой-то ORF указывает на то, что данная рамка считывания, скорее всего, является функционирующим геном.

В митохондриальных транскриптах пшеницы 14 процентов нуклеотидных замен (56 сайтов) оказываются нейтральными и не ведут к аминокислотным изменениям в белках Чем вызвана необходимость эдитинга в этих сайтах ? ? ? Возможно, редактирование приводит к изменению конформации молекул, что облегчает связь с рибосомами

Чем определяется специфичность эдитинга ? ? ? Например, в транскрипте orf 206 редактируется до 68 цитидинов – это 25% всех цитидинов в м. РНК orf 206. Какой механизм определяет редактирование определенного цитидина, а не соседнего с ним? Пока не удалось выявить ни какой-либо консенсусной последовательности, ни какого-то мотива во вторичной структуре, который мог бы служить "указателем" сайта эдитинга

В митохондриальных м. РНК растений огромное количество сайтов эдитинга (500 -1200 точек) Маловероятно наличие специфических белковых молекул, узнающих каждая свой сайт Скорее всего, будут найдены РНК-молекулы, которые могут действовать как трансдетерминанты (подобно g. РHK у кинетопластов), так и цис-детерминанты, образующие специфическую вторичную структуру, узнаваемую ферментами эдитинга

Где же «прячутся» guide РНК в митохондриальном геноме растений? • Информационная емкость генома митохондрий высших растений вполне достаточна для кодирования g. РHK. • Однако, скрининг митохондриального генома у Arabidopsis (200000 нуклеотидов с неустановленной функцией) не выявил антисмысловых последовательностей, которые могли выполнять роль g. РНК. • Интересно, что у маршанции, у которой отсутствует м. РНК эдитинг в митохондриях, "излишней" ДНК значительно меньше – 70000 нуклеотидов

Как соотносятся процессы сплайсинга и эдитинга? Обычно редактирование м. РНК и сплайсинг интронов – два посттранскрипционных процесса, которые происходят параллельно и независимо друг от друга Если сайты эдитинга расположены в самих интронных последовательностях – редактирование предшествует сплайсингу

В большинстве случаев эдитинг белок-кодирующих сайтов приводит к синтезу функционально полноценных белков У табака нарушение эдитинга atp 9 м. РНК препятствует развитию пыльцы генов пшеницы orf 575 и orf 240 эдитинг приводит к замене аргининовых кодонов на триптофановые. Восстанавливается консенсусная последовательность в обоих белках, необходимая для связывания с гемом У У пшеницы эдитинг гена cox 2 по 235 нуклеотиду превращает треониновый кодон в метиониновый. Метионин незаменим в структуре одного из медьсвязывающих доменов COX 2

Редактирование структурных РНК посттранскрипционным изменениям могут подвергаться не только информационные, но и транспортные РНК ядерно кодируемые т. РНКAla A I митохондриально кодируемые дезаминируют 37 -ой аденозин антикодоновой петли эукариот в инозин Данный сайт редактирования обладает поразительным филогенетическим долголетием – он сохранился в клетках от дрожжей до человека

Митохондриальные т. РНК простейшего Acanthamoeba A A U U G*U U U U-A A-U A-U G G G A A C U C U-A G- C U-A A-U Акцепторные участки т. РНК A G A C A-U C-G C-G U-A G A A AC CU AU C-G U-A A-U A G AC G UC G-C A-U U-A A-U A G-C A U U U*G G-C C-G A-U Точки т. РНК эдитинга были предсказаны, а затем все они были найдены Механизм нахождения точек эдитинга как-то связан с вторичной структурой т. РНК Наблюдаются замены: U – A , G – A, A – G, U – G и U – C Редактирование восстанавливает комплементарность оснований

Редактирование т. РНК матриц может изменять кодон-специфичность Ген считался аспарагиновым по гомологии с др. млекопитающими мт-т. РНКAsp нередактир. Didelphis (опоссум) редактир. C Антикодон GCC глицин мт-т. РНКAsp после эдитинга узнает 2 глициновых кодона GGС и GGU U Антикодон GUC аспарагин мт-т. РНКGly обычно узнает 4 кодона - GGN, а у опоссума только 2 - GGА и GGG

У высших растений описано 4 случая т. РНК эдитинга: т. РНКPhe бобы т. РНКHis лиственница т. РНКPhe картофель т. РНКCys энотера – первый известный случай т. РНК эдитинга у голосеменных • У всех видов т. РНК эдитинг предшествует процессингу, • затем наблюдается быстрый процессинг отредактированных молекул, • не прошедшие эдитинг т. РНК не связываются с аминокислотами и деградируют

Формирование фенилаланиновой т. РНК в митохондриях растений – многоступенчатый процесс т. РНКPhe 5’ ДНК транскрипция 5’ РНК-эдитинг 5’ СА 3’ 3’ т-РНКпредшественник “эдитосома” U А 3’ РНКпроцессинг U А CCA достройка A C C U А Зрелая молекула

РНК-редактирование хлоропластного генома кукурузы В рамках гены с сайтами эдитинга, числа в скобках – количество сайтов эдитинга в гене

В хлоропластном геноме значительно меньше сайтов эдитинга, чем в митохондриальном геноме растений Хп кукурузы – 27 сайтов эд. Хп табака – 31 сайт Мт кукурузы – найдено 364 сайта, предполагается > 1200 cайтов Во всех случаях эдитинга хлоропластной м. РНК высших растений выявлены только C-U превращения, тогда как у низших растений обнаружены также U – C замены Проблема специфичности, т. е. нахождения сайтов эдитинга не решена ни для митохондриальной, ни для пластидной м. РНК растений

Сходство пластидных и митохондриальных систем РНК-эдитинга у растений Основной тип превращений как в митохондриальных, так и в хлоропластных РНК: C-U эдитинг Крайне редко в обоих типах органелл отмечается U – C эдитинг Наиболее часто редактируются вторые нуклеотиды кодонов, часто наблюдаются определенные типы превращений • эдитингу подвергаются преимущественно м. РНК • редкие случаи эдитинга описаны для митохондриальных т. РНК, ни одного такого случая до сих пор не зафиксировано в пластидах

Эдитинг у млекопитающих был впервые открыт при анализе экспрессии гена аполипопротеина В (apo. B) apo. B м. РНК печень CAA нередактиров. тонкий кишечник CAA UAA (стоп-кодон) м. РНК редактирование 6666 -го нуклеотида apo B 100 (512 k. Da) apo B 48 (241 k. Da)

Два белка, синтезирующиеся на apo B матрице, выполняют различную роль в метаболизме липидов apo B 48 задействован в транспорте жиров, поступающих с пищей и всасывающихся в кишечнике apo B 100 вовлечен в транспорт эндогенно синтезированных триглицеридов и холестерола Оказалось, что катализирует превращение цитидина в уридин фермент, названный APOBECI и являющийся цинк-содержащей цитидин дезаминазой с молекулярным весом 27 k. Da

Был клонирован ген, кодирующий APOBECI у человека, показана его локализация на 12 -ой хромосоме Экспериментально созданные трансгенные кролики и мыши экспрессировали данный ген в печени, что приводило к "гиперэдитингу" – редактированию других цитозинов в apo. B м. РНК и даже других м. РНК Это вызывало серьезные нарушения функционирования печени вплоть до канцерогенеза

Редактирование ядерных м. РНК Описан эдитинг гена чувствительности к опухоли Вильмса WT 1 Происходит редкое превращение U–C Leu-280 (CUC) заменяется на пролиновый (CCC) подавляется ингибирующее действие WT 1 фактора, что может иметь значение в генезе опухоли

Поиск точек РНК-редактирования (ткани мозга человека) Проанализировано 6768 к. ДНК клонов Участки генома Секвенировано оснований Точек эдитинга Межгенные 346, 113 333 962 Экзоны (транслируемые) 541, 772 0 0 Интроны 1486947 1214 816 Экзоны (5’нетранслируемые) 50, 129 0 0 Экзоны (3’нетранслируемые) 310, 55 9 29 Неизвестные 313, 548 171 545 3, 049, 060 1727 566 ВСЕГО Эдит. / т. п. н. Все точки эдитинга были А-I заменами

Таксон Тип эдитинга Клеточный компартмент Trypanosoma U инсерции/делеции митохондрии Acanthamoeba castellani Spizellomyces punctatus U-A, G-A, A-G, U-C митохондрии Physarum polycephalum инсерции нуклеотидов ( в основном С), С-U конверсии митохондрии Дельта вирус гепатита человека A - I конверсия цитоплазма хозяина Вирусы Ebola A инсерция цитоплазма хозяина Парамиксовирусы G инсерция цитоплазма хозяина Высшие растения С - U конверсии U - С конверсии митохондрии Высшие растения С - U конверсии хлоропласты Млекопитающие С – U; A – I; U- C; G - A U-A конверсии ядро Улитки, однопроходные, сумчатые Различные нуклеотидные конверсии митохондрии Drosophila melanogaster A –I конверсии ядро

В различных генетических системах в редактировании задействованы совершенно непохожие механизмы: вероятно, м. РНК эдитинг неоднократно возникал заново в эволюции ? ? ? Является ли эдитинг "реликтом" пребиотического РНК -ого мира или это позднейшее приобретение Отсутствие эдитинга в органеллах водорослей и некоторых других низших растений говорит в пользу более позднего появления Возникновение эдитинга часто связывают с выходом растений на сушу. Действительно, редактирование выявлено во всех группах наземных растений

Эдитинг наблюдается только у наземных растений эдитинг нет эдитинга семенные растения папоротники Fern allies печеночники Marchantiidae 7 видов Jungermannidae мхи земля вода Сharales 4 вида зеленые водоросли Hornworts (Anthoceros)

РНК-эдитинг – строго специфическое посттранскрипционное изменение информационных и структурных РНК, состоящее во вставках, заменах и выпадениях нуклеотидов Редактирование - необычный, сложный, требующий координирования большого количества факторов, энергоемкий генетический процесс Возникновение РНК-эдитинга в эволюции и его разнообразные проявления во многих генетических системах являются пока во многом непонятным феном Во многих системах роль эдитинга остается загадкой