Лекция № 7 Основы генетики человека. Методы изучения

Лекция № 7 Основы генетики человека. Методы изучения наследственности. Профессор Смирнов Сергей Николаевич 1

План. 1. Основы медицинской генетики. Человек как специфический объект генетического анализа. 2. Методы изучения наследственности человека. 2. Генеалогический метод. 3. Дерматоглифический метод. 4. Иммунологический метод. 5. Биохимический метод. 6. Цитогенетические методы. Кариотипирование. Определения X и Y полового хроматина. 7. Близнецовый метод. 8. Метод гибридизации соматических клеток. 9. Популяционно-статистический метод. 2

1. Основы медицинской генетики. Человек как специфический объект генетического анализа. Методы изучения наследственности человека. Медицинская генетика – область медицины, которая изучает наследственность и изменчивость в популяциях людей, особенности проявления и развития нормальных и патологических признаков, зависимость заболеваний от генетической предрасположенности и условий окружающей среды. Задачи медицинской генетики: выявление, изучение, профилактика и лечение наследственных болезней, разработка путей предотвращения воздействия негативных факторов среды на наследственность человека. 3

В медицинской генетике применяются методы исследования. Для постановки диагноза используются методы: - генеалогический, - дерматоглифический, - цитогенетический, - биохимический, - иммунологический. В исследовательских целях применяются методы: - близнецовый, - популяционно-статистический, - гибридизации соматических клеток, - популяционно-статистический. 4

2. Генеалогический метод предполагает проведение клинико-генеалогического анализа. В нем можно выделить два этапа. Первый - построение родословной. Второй - анализ родословной. 5

Общие принципы построения родословной (генеалогического дерева). - родословная строится от пробанда (пробанд человек, обратившийся к врачу-генетику), построение проводится от потомков к предкам, - родословная строится не менее чем до второй степени родства по горизонтали. - родословная строится не менее чем на три поколения по вертикали, 6

- для объективного построения родословной необходимо обследование членов родословной или анализ медицинских документов. Реже родословная строится по данным опроса (анамнеза), - при построении родословной используются общепринятые условные обозначения. Поколения обозначаются цифрами (чаще римскими) сверху вниз. В пределах поколения сибсы (братья и сестры) размещаются слева направо в порядке рождения и обозначаются арабскими цифрами. 7

Общепринятые условные обозначения, для построения родословных. 8

При анализе родословной решаются следующие задачи: 1) Устанавливается наследственный или ненаследственный характер заболевания (признака), 2) Устанавливается тип или вариант наследования, 4) Устанавливаются генотипы членов родословной, 3) Устанавливается прогноз рождения детей данным признаком или заболеванием, 5) В отдельных случаях рассчитывается пенетрантность. 9

В пользу наследственного характера заболевания свидетельствует наличие его у нескольких членов родословной. Тип наследования можно определить по таким признакам: - у представителей какого пола признак встречается чаще, - кому (дочерям или сыновьям) передается признак от матери и от отца, - присутствует ли наследование по вертикали, - какова вероятность проявления признака в потомстве. 10

Наследование по вертикали - это наследование, при котором признак (заболевание) проявляется во всех поколениях, причем, у больных родителей рождаются больные дети. Наследование по вертикали характерно для доминантных типов наследования. Существует также наследование по горизонтали, при котором у большого числа сибсов наблюдаются случаи заболевания в одном поколении. Наследование по горизонтали характерно для рецессивных типов наследования. 11

Типы наследования признаков (заболеваний): - аутосомно-рецессивный, - аутосомно-доминантный, - Х-сцепленный рецессивный, - Х-сцепленный доминантный, - Y-сцепленный (голандрический). 12

Родословная с аутосомно-доминантным типом наследования признака. 13

Родословная с аутосомно-рецессивным типом наследования признака. 14

Родословные с Х-сцепленным доминантным типом наследования признака. 15

Родословная с Х-сцепленным рецессивным типом наследования признака. 16

Родословная с Y-сцепленным (голандрическим) типом наследования признака. 17

3. Дерматоглифический метод. Дерматоглифический анализ предполагает исследование характера узоров (дерматоглифов) на пальцах (дактилоскопия), на ладонях (пальмоскопия) и на стопах (плантоскопия). В медицинской генетике дерматоглифический метод (дерматоглифический анализ) применяется для установления предварительного диагноза ряда наследственных заболеваний. Узоры образуются папиллярными линиями. Папиллярные линии - линейные возвышения эпидермиса на подушечках пальцев, на внутренних поверхностях кистей рук и на подошвах ног. Их структура определяется сосочками дермы. 18 18

Слои дермы: 1 - сетчатый, 2 - сосочковый. 3 - эпидермис. 19

Схема строения кожи. 20

Дактилоскопия. В норме на подушечках пальцев могут формироваться различные узоры. Впервые систематизировал узоры английский антрополог Френсис Гальтон. Наиболее распространенны них дуга (A - arch), петля (L – loop), завиток (W - whorl). Петли бывают радиальные LR и ульнарные LU (в зависимости от того, куда они открываются). 21

Дуга Петля Завиток 22

Понятие об ульнарности и радиальности. Нужно определить, куда смотрит открытый конец петли. 23

Трирадиус (дельта) место схождения трех папиллярных линий. 24

Стандартная дуга, трирадиусов нет. 25

Стандартная петля, один трирадиус. 26

Завиток, два трирадиуса. 27

Основные компоненты дактилоскопического рисунка. 28

Оценивается также гребневый счет - число папиллярных линий, которых пересекает условная линия, проведенная от центра рисунка к трирадиусу. 29

Пальмоскопия. На ладони выделяют несколько зон. В каждой из этих зон можно оценить характер папиллярного узора. I - подпальцевый участок, II - гипотенар (ульнарный участок), III - тенар (радиальный участок). 30

На ладони существуют несколько трирадиусов: трирадиусы A, B, C, D у оснований пальцев и осевой трирадиус (Т) у браслетной складки. Диагностически ценно измерение величины угла АТD. Этот угол в норме не больше 57 градусов. 31

На ладони есть ладонные складки (флексорные линии). Выделяют три главные линии (первичные ладонные складки): две поперечные и одна складка у основания первого пальца. На ладони имеются и другие менее выраженные сгибательные линии и складки. 32

При патологии две поперечные ладонные складки могут сливаться, образовывая четырехпальцевую складку. 33

Плантоскопия. Рельеф кожного покрова подошвы ступней ног. I - папиллярные узоры на пальцах ног. II - папиллярные узоры на плюсне, лежащий в основании плюсны. III- папиллярный узор свода. IV- папиллярный узор пяточной части стопы. 34

4. Иммунологический метод. В медицинской генетике иммунологические методы применяются для установления окончательного диагноза наследственных заболеваний, обусловленных патологией иммунной системы. Иммунологическими методами диагностики устанавливают состояния клеточного иммунитета (например, определение В- и Т-лимфоцитов) и определение состояния гуморального иммунитета (например, уровня сывороточных иммуноглобулинов). Например: Синдром Вискотта-Олдрича наследственное заболевание. Характеризуется экземой, тромбоцитопенией и иммунодефицитом. Присутствует дефицит T-лимфоцитов, снижен уровень Ig. M в сыворотке 35 крови.

5. Биохимический метод. Биохимические методы исследований используются для установления диагноза заболеваний обмена веществ. Исследованию подлежат кровь, моча, ликвор, пунктаты костного мозга и другие. Есть два организационных этапа биохимических исследований. На первом этапе (экспресс-диагностика) применяются методы массового биохимического скрининга. Например, пробы Феллинга (на фенилкетонурию), Альтгаузена (гликогенозы). Эти пробы достаточно просты, дешевы и используют доступный биологический материал. 36

На втором этапе (уточняющая диагностика) применяют молекулярно-цитогенетические, молекулярнобиологические методы, более сложные методы аналитической биохимии: - исследование метаболического пути (количественное определение метаболитов, их кинетики и накопления); - прямое измерение концентрации (иммунохимические методы), активности (энзимо-диагностика), физикохимических и кинетических параметров мутантных белков; - исследование мутантных белков с помощью нагрузочных проб мечеными субстратами и гибридизации соматических клеток; - исследование структуры мутантного гена методами рестрикционного анализа. 37

6. Цитогенетические методы. Кариотипирование. Определения X и Y полового хроматина. Цитогенетические методы – это методы, направленные на установление величины, формы и числа хромосом. Цитогенетические методы применяются для установления диагноза хромосомных болезней. Наиболее распространены методы: - определение полового хроматина, - хромосомный анализ (кариотипирование). 38

Определение полового хроматина - это метод, направленный на установление количества телец Х или Y полового хроматина. Метод позволяет ориентировочно определить число половых хромосом, которое равно количеству глыбок полового хроматина плюс 1. Х-половой хроматин - это спирализованная Ххромосома (в норме у женщин одна Х-хромосома деспирализована, а вторая - спирализована). Впервые глыбки Х-полового хроматина в 1949 году обнаружили английские исследователи М. Барр и Л. Бертрам). Поэтому они называются тельца Барра. 39

Для определения количества телец Барра используют материал букальных или вагинальных соскобов, а также кровь. После фиксации его окрашивают ацетарсеином и микроскопируют. Тельца Барра представляют собой глыбки гетерохроматина, расположенные, как правило, по периферии ядра. Если в одной клетке присутствует одно тельце полового хроматина, то число Х-хромосом 2. Если число телец Ххроматина 2, то Х-хромосом 3. 40

Х-половой хроматин (“барабанные палочки”) в гранулоците женщины. 1 - один из сегментов ядра нейтрофильного лейкоцита; 2 - Х-половой хроматин: имеет вид барабанной палочки, связанной с сегментом ядра. 41

Y-хроматин открыт в 1970 шведскими учёными Т. Касперсоном и Л. Цех. Для выявления мужского Y-полового хроматина (F-тельце) мазки окрашивают акрихином и просматривают с помощью люминисцентного микроскопа. Y-хроматин выявляют в виде сильно светящейся точки, по величине и интенсивности свечения отличающейся от остальных хромоцентров. Он обнаруживается в ядрах клеток мужского организма. 42

Хромосомный анализ (кариотипирование) - метод, направленный на определение числа, размеров и формы хромосом. Указанные параметры устанавливают при микроскопировании хромосом в момент метафазы митоза (метафазные хромосомы). Метод позволяет установить окончательный диагноз хромосомного заболевания. Различают прямое и непрямое кариотипирование. 43

Материалом для непрямого кариотипирования обычно служит периферическая кровь, реже - другие ткани, клетки которых в данный момент не делятся митозом. Кровь забирают в раствор гепарина (профилактика свертывания). Затем Кровь вносят в культуральную среду (среда Игла, бычья сыворотка) и добавляют митоген (как правило фитогемагглютинин - ФГА). Культуральная среда необходима для культивирования клеток крови в течение 72 часов. Культивирование осуществляют при +37 градусах Цельсия. За это время ФГА переводит лимфоциты и другие ядросодержащие клетки крови в митоз. 44

После семидесяти двух часов экспонирования вносят колхицин, который разрушает веретено деления и останавливает митоз. Экспонирование в присутствии колхицина длится 1 -1, 5 часа. После этого проводят центрифугирование. Надосадочную жидкость сливают, а в осадок клеток добавляют гипотонический раствор КСl. Экспонируют до 30 минут. За это время клетки набухают, их мембраны разрушаются и хромосомы располагаются, не перекрывая друга. 45

Повторено проводят центрифугирование. Надосадочную жидкость сливают. Осадок фиксируют около полутора часов. В качестве фиксатора применяют смесь уксусной кислоты и метанола. Далее следует окрашивание. Окрашивание может быть рутинным (гематоксилином), или дифференцирующим (краситель Гымза, флуоресцентные красители). 46

При рутинном окрашивании хромосомы красятся гомогенно, а при дифференцирующем окрашивании в них определяются темные и светлые диски. В результате микроскопирования и анализа кариотипа после рутинного окрашивания хромосомы могут быть отнесены к определенным группам по Денверской классификации. После дифференцирующего окрашивания возможно отнесение хромосом к определенной паре. Для объективного документирования или в исследовательских целях проводят фотографирование препаратов. 47

Прямое кариотипирование отличается от непрямого тем, что для анализа берутся ткани, клетки которых в данный момент делятся митозом. Поэтому, обработка материала начинается с фиксации с последующим окрашиванием. Материалом может служить костный мозг, полученный в результате стернальной пункции. 48

Рутинное окрашивание. Идеограмма нормального кариотипа женщины. 49

Рутинное окрашивание. Распределение хромосом по группам по Денверской классификации. 50

Схематическое изображение хромосом человека при дифференцирующем окрашивании. 51

В настоящее время существуют системы для автоматизированного проведения хромосомного анализа (кариотипирования). Эти системы позволяют анализировать изображения метафаз окрашенных хромосом: выделять хромосомы и строить кариограмму. 52

7. Близнецовый метод применяется в исследовательских целях для установления роли наследственности и среды в развитии того или иного заболевания (признака). Метод заключается в исследовании близнецовых пар. Близнецы бывают монозиготными (развиваются из одной оплодотворенной яйцеклетки) и дизиготными (развиваются из разных оплодотворенных яйцеклеток). 53

Монозиготные близнецы имеют одинаковый генотип. Если они живут в разных условиях, то развитие разных признаков у них свидетельствует о значительной роли среды в развитии этих признаков. 54

Дизиготные близнецы имеют разный генотип. Если они живут в одинаковых условиях среды, то развитие разных признаков у них свидетельствует о значительной роли наследственности в развитии этих признаков. 55

Для более точной оценки роли наследственности и среды в развитии признака (заболевания) используют математические методы. Наиболее известной является формула Хольцингера: %КМБ - %КДБ Н = -------------, 100% - %КДБ где Н - коэффициент наследственности, %КМБ - процент конкордантности монозиготных близнецов, %КДБ - процент конкордантности дизиготных близнецов. 56

Конкордантность - это явление, при котором близнецы имеют один и тот же признак. Например, оба болеют одной болезнью. Дискордантность - это явление, при котором близнецы имеют разные признаки. Например, один болеет, а другой здоров. Если коэффициент наследственности больше 50%, то в формировании признака преобладает наследственность, если меньше 50% - преобладает среда. 57

8. Метод гибридизации соматических клеток. Гибридизация соматических клеток - это слияние совместно культивируемых клеток разных видов, образующих гибридные клетки со свойствами обоих родительских видов. Гибридные клетки, содержащие два полных генома, при делении могут утрачивать хромосомы одного из видов. Можно получать клетки с желаемым набором хромосом, изучать сцепление генов и их локализацию в определенных хромосомах. Методы генетики соматических клеток позволяют изучать механизмы первичного действия и взаимодействия генов, регуляцию генной активности. 58

9. Популяционно-статистический метод. Популяционная генетика – это раздел генетики, изучающий закономерности существования генофонда и динамику изменчивости в популяциях. Популяция - это совокупность особей одного вида, достаточно долго живущих на определенной территории (пространстве), где осуществляется та или иная степень панмиксии, отделенная от соседних совокупностей теми или иными изоляционными барьерами. 59

Одна из задач популяционной генетики – определение генных, генотипических и фенотипических частот. Генная частота - это доля доминантных и рецессивных аллелей гена в популяции. Генотипическая частота - это доля особей с определенным генотипом в популяции. Фенотипическая частота - это доля особей с определенным фенотипом в популяции. 60

Один из законов, описывающих закономерности изменения генных и генотипических частот, является закон генетического равновесия Харди-Вайнберга. Сформулирован в 1908 независимо английским математиком Г. Харди и немецким врачом В. Вайнбергом. Формулировка закона. В идеальной популяции генные и генотипические частоты имеют тенденцию сохранятся постоянными. Идеальная популяция - это популяция бесконечно больших размеров, в которой осуществляется панмиксия (свободное скрещивание), не действуют эволюционные факторы: давление естественного отбора, мутации, миграции, изоляции, дрейф генов, популяционные волны. 61

Математическое выражение закона Харди. Вайнберга: p 2 + 2 pq + = 1 p + q = 1, где p - генная частота доминантного аллеля, q – генная частота рецессивного аллеля, p 2 - генотипическая частота доминантных гомозигот, 2 pq - генотипическая частота гетерозигот, q 2 - генотипическая частота рецессивных гомозигот. Для случая, когда ген представлен тремя аллелями выражение приобретает вид: (p + q + r)2 = 1 62

Закон Харди - Вайнберга для двух аллелей: по оси абсцисс показаны частоты аллелей p и q, по оси ординат - частоты генотипов. Каждая кривая соответствует одному из трех возможных генотипов. 63

Популяции людей не являются идеальными, поэтому закон Харди - Вайнберга применим с допущениями лишь на небольшом числе поколений. Особенность современного состояния человечества приводит к тому, что вследствие массовых миграций популяционная структура стирается. В единичных случаях сохраняются небольшие изолированные популяции (демы и изоляты) характеризующиеся малочисленностью, очень слабой миграцией и высокой частотой родственных браков. 64

Благодарю за внимание! 65