Скачать презентацию Лекция 6 Кинетика ферментативного катализа Регуляция активности Скачать презентацию Лекция 6 Кинетика ферментативного катализа Регуляция активности

Кинетика. Регуляция активности ферментов.ppt

  • Количество слайдов: 33

Лекция № 6 Кинетика ферментативного катализа. Регуляция активности ферментов. Лекция № 6 Кинетика ферментативного катализа. Регуляция активности ферментов.

1. Методы определения количества ферментов 2. Наиболее часто используемые: 1) Колориметрические - основаны на 1. Методы определения количества ферментов 2. Наиболее часто используемые: 1) Колориметрические - основаны на определении образующихся в ходе реакции окрашенных веществ. Спектрофотометрические – основаны на поглощении света в определенных участках спектра субстратами и продуктами реакции, реже активными группами ферментов. Определение активности НАД – зависимых дегидрогеназ

2. Способы выражения активности ферментов. Используются 2 основные единицы: 1) КАТАЛ – такое количество 2. Способы выражения активности ферментов. Используются 2 основные единицы: 1) КАТАЛ – такое количество фермента, которое может осуществить превращение 1 моль субстрата за 1 сек. 2) Катал = Моль/с, мк. Моль/с, н. Моль/с 3) 2) IU - International Units 4) МЕ( международная единица) – то количество любого фермента, которое катализирует превращение 1 мк. Моля субстрата в минуту при заданных условиях. 5) МЕ = мк. Моль / мин 6) Активность ферментов в сыворотке и плазме крови - в единицах на 1 литр : МЕ/л, Е/л 7) IU(МЕ) нкат/л 8) 1 МЕ = 16, 67 нкат/л К = 16, 67

3. Кинетика ферментативных реакций Ферментативная кинетика занимается исследованием закономерностей влияния химической природы реагирующих веществ 3. Кинетика ферментативных реакций Ферментативная кинетика занимается исследованием закономерностей влияния химической природы реагирующих веществ и условий их взаимодействия на скорость ферментативной реакции. РАССМОТРИМ ФАКТОРЫ , КОТОРЫЕ ВЛИЯЮТ НА СКОРОСТЬ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ РЕАКЦИИ:

1) Зависимость скорости от вида субстрата. Ферменты обладают избирательностью действия специфичность действия: 1 – 1) Зависимость скорости от вида субстрата. Ферменты обладают избирательностью действия специфичность действия: 1 – Абсолютная специфичность. - фермент превращает только 1 субстарат. Стереохимическая специфичность – разновидность абсолютной. ( ЛДГ осуществляет превращение только L- лактата) 1) NH 2 2) C = NH 3) NH 4) (CH 2)3 5) CH – NH 2 6) COOH 7) NH 2 (CH 2)3 C=O NH 2 + NH 2 аргинин NH 2 Уреаза 2 NH 3 + CO 2 C=O тиомочевина CH – NH 2 COOH мочевина Уреаза 8) С = O 9) NH 2 аргиназа NH 2 орнитин

2 – Относительная специфичность ( объясняется тем, что, активный центр ферментов, обладающих относительной специфичностью 2 – Относительная специфичность ( объясняется тем, что, активный центр ферментов, обладающих относительной специфичностью не жесткая структура, он может менять свою конформацию при образование E-S комплекса, и с каждым S эта конформация своя. ) 1) O Эстеразы R – C – O – R 1 2) R – O – PO 3 H 2 Н 2 О Фосфостеразы Н 2 О O R – C – OH R – OH + + R 1 – OH H 3 PO 4

2) Влияние [S] на скорость реакции. Теоретический график зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации 2) Влияние [S] на скорость реакции. Теоретический график зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата при постоянной концентрации фермента. ( Михаэлиса – Ментен) V V max Б) V max / 2 А) В) Vo = V max х [S] + Km Km [S] а) – реакция первого порядка (при [S] < Km скорость реакции пропорциональна [S]) б) – реакция смешанного порядка ( скорость пропор. конц. реаг. в-в) в) – реакция нулевого порядка ( высокая скорость , не зависящая от [S].

График Лайнуивера – Берка, построенный по методу двойных обратных величин. 1 / V 0 График Лайнуивера – Берка, построенный по методу двойных обратных величин. 1 / V 0 Наклон = Km / Vmax 1 V = Km V max x 1 S + 1 V max 1 / [S] - 1 / Km

3) Зависимость V скорости реакции от концентрации фермента. 3 Х 2 Х 1 Х 3) Зависимость V скорости реакции от концентрации фермента. 3 Х 2 Х 1 Х t, время V 4) Зависимость скорости реакции от температуры. Повышение концентрации фермнета 4 Х Opt 40 o 50 o 60 o t, время

4) Зависимость скорости реакции от р. Н среды. A Пепсин Амилаза 1 2 3 4) Зависимость скорости реакции от р. Н среды. A Пепсин Амилаза 1 2 3 4 5 6 В норме р. Н цитозоля =7, 2 Аргиназа 7 8 ФЕРМЕНТ Орt р. Н Пепсин 1, 5 Амилаза слюны 6, 8 – 7, 0 Трипсин 7, 7 Каталаза 7, 6 Уреаза 7, 0 – 7, 2 Липаза 7, 0 – 8, 5 Щелочная фосфатаза 10 9 10 р. Н

Область обратимой активации A Область полной стабильности Активность ферментов при различных р. Н Денатурация Область обратимой активации A Область полной стабильности Активность ферментов при различных р. Н Денатурация трипсин пепсин 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 р. Н Ход ферментативной реакции во времени V I I – переходный участок II II – участок начальной скорости реакции в стационарной фазе III – участок основного протекания реакции t

Влияние различных веществ на активность ферментов 1. АКТИВАТОРЫ ФЕРМЕНТОВ 1. 1. Активация ферментов ионами Влияние различных веществ на активность ферментов 1. АКТИВАТОРЫ ФЕРМЕНТОВ 1. 1. Активация ферментов ионами металлов Ионы Mg+2, Mn+2, Zn+2, Co+2, K+ • Входят в состав простетической группы фермента, компонент активного центра • Облегчают образование ES - комплекса • Способствуют присоединению кофермента к апоферменту • Обеспечивают становление четвертичной структуры фермента • Действуют иными путями: - создание каталитически активной конформации белка - влияние на поверхностный заряд молекулы фермента - удаление ингибитора - вытеснение неэффективного иона из связи с ферментом

Механизм активации ферментов металлами 1. В состав активного центра: Н 2 О + СО Механизм активации ферментов металлами 1. В состав активного центра: Н 2 О + СО 2 Zn: КА Н 2 СО 3 Е + Ме ЕМе + S EMe. S 2. Присоединение к субстрату: КФК АТФ + креатин Mg++ + АТФ креатинфосфат + АДФ Mg++АТФ Комплекс металл - субстрат Креатин + Mg++АТФ креатинфосфат + АДФ + Mg++

Регуляция ферментов анионами Cl Br Активность амилазы в присутствии различных ионов Обычные условия 1 Регуляция ферментов анионами Cl Br Активность амилазы в присутствии различных ионов Обычные условия 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Активация ферментов 1) Ионами металлов 2) Восстановленными соединениями 3) 4) 5) S AH 2 Активация ферментов 1) Ионами металлов 2) Восстановленными соединениями 3) 4) 5) S AH 2 ( NADH 2) E SH E S SH 6) неактивный 7) 3) Частичный протеолиз 8) 9) пепсиноген HCl пепсин 10)4) Аллостерическими активаторами ( АДФ, АМФ) 11)5) Гормонами через посредников: ц. АМФ, ц. ГМФ

Реакции ингибирования ферментативных процессов. ТИПЫ ИНГИБИРОВАНИЯ ФЕРМЕНТОВ I. Обратимое II. Необратимое 1. Конкурентное Неконкурентное Реакции ингибирования ферментативных процессов. ТИПЫ ИНГИБИРОВАНИЯ ФЕРМЕНТОВ I. Обратимое II. Необратимое 1. Конкурентное Неконкурентное 2. Бесконкуренетное Смешанного типа Для определения обратимости ингибирования проводят диализ среды, где есть фермент и ингибитор. Если после диализа восстанавливается активность фермента, то торможение - обратимое.

1. Конкурентный тип ингибирования Осуществляется веществом, близким по химическому строению к субстату. 1 / 1. Конкурентный тип ингибирования Осуществляется веществом, близким по химическому строению к субстату. 1 / Vo [I] Vo V max Без ингибитора V max / 2 tg α = Km/ Vmax 1/ Vmax Km E + I Ki EI [S] ; -1 / Km K ing = [E] [ I ] / [ EI ] 1/[S]

2. Неконкурентное торможение Ингибитор реагирует с ферментом иным образом , чем субстрат, и поэтому 2. Неконкурентное торможение Ингибитор реагирует с ферментом иным образом , чем субстрат, и поэтому повышение концентрации субстрата не может вытеснить ингибитор и восстановить активность фермента 1/V o Vo V max tg α = Km/ Vmax 1/ Vmax Km E + I EI [S] ; ES + I - 1 / Km ESI Km = const V max

3. Бесконкурентное торможение Ингибитор взаимодействует с фермент – субстратным комплексом. 1/V o [I] без 3. Бесконкурентное торможение Ингибитор взаимодействует с фермент – субстратным комплексом. 1/V o [I] без ингибитора - 1 / Km I 2 ES + I 1/ Vmax - 1 / Km I 1 - 1 / Km Km ESI Vmax 1/S 4. Смешанный тип торможения Ингибитор взаимодействует с ферментом в различных участках молекулы.

Ингибиторы взаимодействуют с ферментами различными путями, они могут: Блокировать активный центр фермента Менять четвертичную Ингибиторы взаимодействуют с ферментами различными путями, они могут: Блокировать активный центр фермента Менять четвертичную структуру фермента Блокировать часть фермента, соединяющуюся с коферментом, активатором Нарушать взаимодействие фермента с субстратом Соединяться с коферментом, активатором Вызывать денатурацию фермента (неспецифические ингибиторы) Связываться с аллостерическим центром

Классификация ингибиторов 1) специфические 2) неспецифические 3) Необратимого действия конкурентные 6) Вызывающие ковалентную модификацию Классификация ингибиторов 1) специфические 2) неспецифические 3) Необратимого действия конкурентные 6) Вызывающие ковалентную модификацию фермента: фосфатную, ацетатную 5) Аллостерические 4) Обратимого действия неконкурентные

Ингибирование сериновых гидролаз (АХЭ) диизопропилфторфосфатом (ДФФ) ДФФ Остаток серина в активном центре Сериновые протеиназы: Ингибирование сериновых гидролаз (АХЭ) диизопропилфторфосфатом (ДФФ) ДФФ Остаток серина в активном центре Сериновые протеиназы: Химотрипсин, эластаза, тромбин, субтилизин Каталитически неактивный эфир

Необратимое ингибирование Тиоловый фермент Йодацетамид (йодацетат) Химически модифицированный фермент ( неакт. ) Необратимое ингибирование Тиоловый фермент Йодацетамид (йодацетат) Химически модифицированный фермент ( неакт. )

Необратимое ингибирование Трансацилаза –один из ферментов, участвующих в биосинтезе клеточной стенки бактерий. R = Необратимое ингибирование Трансацилаза –один из ферментов, участвующих в биосинтезе клеточной стенки бактерий. R = CO NH - CH 2 OH S (CH 3)2 + Пенициллин O= N Трансацилаза (активен) Необратимое ингибирование R = CO NH - CH 2 O - С O= Пенициллиноил – ферментный комплекс (неактивен) COO- S (CH 3)2 НN COO-

Необратимое ингибирование цистеина • ТОКСИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ Hg++ Pb++ , соединений мышьяка объясняется образованием ковалентной Необратимое ингибирование цистеина • ТОКСИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ Hg++ Pb++ , соединений мышьяка объясняется образованием ковалентной связи фермента с ингибитором -> необратимое изменение конформации Химически модифицированный фермент ( неакт. )

Неконкурентное ингибирование 1. SH –групп ионами тяжелых металлов (Cu++, Hg++, As++, Pb++) 2. E Неконкурентное ингибирование 1. SH –групп ионами тяжелых металлов (Cu++, Hg++, As++, Pb++) 2. E – SH + Ag+ E – S – Ag + H + Активный Неактивный 3. 2. Агентами, связывающими Ме++, которые необходимы для активации фермента. 4. - цианиды образуют комплексы с Fe++, Fe+++ 5. - ЭДТА с Ме++ -> ингибирование ферментов 6. - тетрациклины связывают ионы Ме 7. 3. Синильная кислота, СО сязывают Fe++ в цитохромоксидазе

Неконкурентное ингибирование монотиоловых ферментов HCl - SH + - SH Cl Cl (Хлорвиниларсины) Акт. Неконкурентное ингибирование монотиоловых ферментов HCl - SH + - SH Cl Cl (Хлорвиниларсины) Акт. As – CH = CH - Cl НS-R -S As – CH = CH - Cl + -S Неактивен -S Неактивный Е НS-R R-S As – CH = CH - Cl + НS-CH 2 НS-CH НO-CH 2 As – CH = CH - Cl Люизит Реактивация Е: БАЛ -S SO 3 Na-CH 2 Унитиол 2 HS -

Конкурентное ингибирование Биоснтез ДНК, РНК Предшественники ТГФК Фолиевая кислота СУЛЬФАНИЛАМИД ТГФК Кофермент в биосинтезе Конкурентное ингибирование Биоснтез ДНК, РНК Предшественники ТГФК Фолиевая кислота СУЛЬФАНИЛАМИД ТГФК Кофермент в биосинтезе пуринов и пиримидинов

Структуры основных ингибиторов Ахэ CH 3 O CH 3 – N – CH 2 Структуры основных ингибиторов Ахэ CH 3 O CH 3 – N – CH 2 – O – CH 3 Ацетилхолин CH 3 O CH 3 – N – CH 2 – O – C – NH 2 Карбаминоилхолин CH 3 O CH 3 C O C N H 3 C Прозерин CH 3 N+ H 3 C Ингибиторы обратимого типа CH 3 СH 3 CH - O - P = O CH 3 F Зарин ( образует продукт фосфорилирования АХЭ) O CH 3 – N – CH 2 – O – P - F CH 3 Метилфторфосфорилхолин ( исключительно сильное анти. ХЭ действие)

Аллостерическое ингибирование Аллостерический центр (НАДН 2, АТФ) + Vo I Е V max Vo Аллостерическое ингибирование Аллостерический центр (НАДН 2, АТФ) + Vo I Е V max Vo EI - комплекс V max + 0 V max - V max К 0, 5 возрастает под действием отрицательного кодулятора [S] K 0, 5 [S] Vmax изменяется, а К 0, 5 почти const

Фосфатная модификация ферментов Е - ОН Активный фермент Протеинкиназа АТФ АДФ Е – О Фосфатная модификация ферментов Е - ОН Активный фермент Протеинкиназа АТФ АДФ Е – О – РО 3 Н 2 Неактивный фермент

Ингибирование фермента путем ацетатной модификации PES - NH 2 + Простагландинэндопироксидсинтаза (ее циклогеназный компонент) Ингибирование фермента путем ацетатной модификации PES - NH 2 + Простагландинэндопироксидсинтаза (ее циклогеназный компонент) O || Н 3 С-С-О COO- Аспирин (ацетилсалициловая кислота) O || Н 3 С-С PES - N COO+ НО Н Ацилированный фермент с блокированным центром Салициловая кислота