Лекция 6 Кинетика ферментативного катализа Регуляция активности

Лекция № 6 Кинетика ферментативного катализа. Регуляция активности ферментов.

1. Методы определения количества ферментов 2. Наиболее часто используемые: 1) Колориметрические - основаны на определении образующихся в ходе реакции окрашенных веществ. Спектрофотометрические – основаны на поглощении света в определенных участках спектра субстратами и продуктами реакции, реже активными группами ферментов. Определение активности НАД – зависимых дегидрогеназ

2. Способы выражения активности ферментов. Используются 2 основные единицы: 1) КАТАЛ – такое количество фермента, которое может осуществить превращение 1 моль субстрата за 1 сек. 2) Катал = Моль/с, мк. Моль/с, н. Моль/с 3) 2) IU - International Units 4) МЕ( международная единица) – то количество любого фермента, которое катализирует превращение 1 мк. Моля субстрата в минуту при заданных условиях. 5) МЕ = мк. Моль / мин 6) Активность ферментов в сыворотке и плазме крови - в единицах на 1 литр : МЕ/л, Е/л 7) IU(МЕ) нкат/л 8) 1 МЕ = 16, 67 нкат/л К = 16, 67

3. Кинетика ферментативных реакций Ферментативная кинетика занимается исследованием закономерностей влияния химической природы реагирующих веществ и условий их взаимодействия на скорость ферментативной реакции. РАССМОТРИМ ФАКТОРЫ , КОТОРЫЕ ВЛИЯЮТ НА СКОРОСТЬ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ РЕАКЦИИ:

1) Зависимость скорости от вида субстрата. Ферменты обладают избирательностью действия специфичность действия: 1 – Абсолютная специфичность. - фермент превращает только 1 субстарат. Стереохимическая специфичность – разновидность абсолютной. ( ЛДГ осуществляет превращение только L- лактата) 1) NH 2 2) C = NH 3) NH 4) (CH 2)3 5) CH – NH 2 6) COOH 7) NH 2 (CH 2)3 C=O NH 2 + NH 2 аргинин NH 2 Уреаза 2 NH 3 + CO 2 C=O тиомочевина CH – NH 2 COOH мочевина Уреаза 8) С = O 9) NH 2 аргиназа NH 2 орнитин

2 – Относительная специфичность ( объясняется тем, что, активный центр ферментов, обладающих относительной специфичностью не жесткая структура, он может менять свою конформацию при образование E-S комплекса, и с каждым S эта конформация своя. ) 1) O Эстеразы R – C – O – R 1 2) R – O – PO 3 H 2 Н 2 О Фосфостеразы Н 2 О O R – C – OH R – OH + + R 1 – OH H 3 PO 4

2) Влияние [S] на скорость реакции. Теоретический график зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата при постоянной концентрации фермента. ( Михаэлиса – Ментен) V V max Б) V max / 2 А) В) Vo = V max х [S] + Km Km [S] а) – реакция первого порядка (при [S] < Km скорость реакции пропорциональна [S]) б) – реакция смешанного порядка ( скорость пропор. конц. реаг. в-в) в) – реакция нулевого порядка ( высокая скорость , не зависящая от [S].

График Лайнуивера – Берка, построенный по методу двойных обратных величин. 1 / V 0 Наклон = Km / Vmax 1 V = Km V max x 1 S + 1 V max 1 / [S] - 1 / Km

3) Зависимость V скорости реакции от концентрации фермента. 3 Х 2 Х 1 Х t, время V 4) Зависимость скорости реакции от температуры. Повышение концентрации фермнета 4 Х Opt 40 o 50 o 60 o t, время

4) Зависимость скорости реакции от р. Н среды. A Пепсин Амилаза 1 2 3 4 5 6 В норме р. Н цитозоля =7, 2 Аргиназа 7 8 ФЕРМЕНТ Орt р. Н Пепсин 1, 5 Амилаза слюны 6, 8 – 7, 0 Трипсин 7, 7 Каталаза 7, 6 Уреаза 7, 0 – 7, 2 Липаза 7, 0 – 8, 5 Щелочная фосфатаза 10 9 10 р. Н

Область обратимой активации A Область полной стабильности Активность ферментов при различных р. Н Денатурация трипсин пепсин 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 р. Н Ход ферментативной реакции во времени V I I – переходный участок II II – участок начальной скорости реакции в стационарной фазе III – участок основного протекания реакции t

Влияние различных веществ на активность ферментов 1. АКТИВАТОРЫ ФЕРМЕНТОВ 1. 1. Активация ферментов ионами металлов Ионы Mg+2, Mn+2, Zn+2, Co+2, K+ • Входят в состав простетической группы фермента, компонент активного центра • Облегчают образование ES - комплекса • Способствуют присоединению кофермента к апоферменту • Обеспечивают становление четвертичной структуры фермента • Действуют иными путями: - создание каталитически активной конформации белка - влияние на поверхностный заряд молекулы фермента - удаление ингибитора - вытеснение неэффективного иона из связи с ферментом

Механизм активации ферментов металлами 1. В состав активного центра: Н 2 О + СО 2 Zn: КА Н 2 СО 3 Е + Ме ЕМе + S EMe. S 2. Присоединение к субстрату: КФК АТФ + креатин Mg++ + АТФ креатинфосфат + АДФ Mg++АТФ Комплекс металл - субстрат Креатин + Mg++АТФ креатинфосфат + АДФ + Mg++

Регуляция ферментов анионами Cl Br Активность амилазы в присутствии различных ионов Обычные условия 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Активация ферментов 1) Ионами металлов 2) Восстановленными соединениями 3) 4) 5) S AH 2 ( NADH 2) E SH E S SH 6) неактивный 7) 3) Частичный протеолиз 8) 9) пепсиноген HCl пепсин 10)4) Аллостерическими активаторами ( АДФ, АМФ) 11)5) Гормонами через посредников: ц. АМФ, ц. ГМФ

Реакции ингибирования ферментативных процессов. ТИПЫ ИНГИБИРОВАНИЯ ФЕРМЕНТОВ I. Обратимое II. Необратимое 1. Конкурентное Неконкурентное 2. Бесконкуренетное Смешанного типа Для определения обратимости ингибирования проводят диализ среды, где есть фермент и ингибитор. Если после диализа восстанавливается активность фермента, то торможение - обратимое.

1. Конкурентный тип ингибирования Осуществляется веществом, близким по химическому строению к субстату. 1 / Vo [I] Vo V max Без ингибитора V max / 2 tg α = Km/ Vmax 1/ Vmax Km E + I Ki EI [S] ; -1 / Km K ing = [E] [ I ] / [ EI ] 1/[S]

2. Неконкурентное торможение Ингибитор реагирует с ферментом иным образом , чем субстрат, и поэтому повышение концентрации субстрата не может вытеснить ингибитор и восстановить активность фермента 1/V o Vo V max tg α = Km/ Vmax 1/ Vmax Km E + I EI [S] ; ES + I - 1 / Km ESI Km = const V max

3. Бесконкурентное торможение Ингибитор взаимодействует с фермент – субстратным комплексом. 1/V o [I] без ингибитора - 1 / Km I 2 ES + I 1/ Vmax - 1 / Km I 1 - 1 / Km Km ESI Vmax 1/S 4. Смешанный тип торможения Ингибитор взаимодействует с ферментом в различных участках молекулы.

Ингибиторы взаимодействуют с ферментами различными путями, они могут: Блокировать активный центр фермента Менять четвертичную структуру фермента Блокировать часть фермента, соединяющуюся с коферментом, активатором Нарушать взаимодействие фермента с субстратом Соединяться с коферментом, активатором Вызывать денатурацию фермента (неспецифические ингибиторы) Связываться с аллостерическим центром

Классификация ингибиторов 1) специфические 2) неспецифические 3) Необратимого действия конкурентные 6) Вызывающие ковалентную модификацию фермента: фосфатную, ацетатную 5) Аллостерические 4) Обратимого действия неконкурентные

Ингибирование сериновых гидролаз (АХЭ) диизопропилфторфосфатом (ДФФ) ДФФ Остаток серина в активном центре Сериновые протеиназы: Химотрипсин, эластаза, тромбин, субтилизин Каталитически неактивный эфир

Необратимое ингибирование Тиоловый фермент Йодацетамид (йодацетат) Химически модифицированный фермент ( неакт. )

Необратимое ингибирование Трансацилаза –один из ферментов, участвующих в биосинтезе клеточной стенки бактерий. R = CO NH - CH 2 OH S (CH 3)2 + Пенициллин O= N Трансацилаза (активен) Необратимое ингибирование R = CO NH - CH 2 O - С O= Пенициллиноил – ферментный комплекс (неактивен) COO- S (CH 3)2 НN COO-

Необратимое ингибирование цистеина • ТОКСИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ Hg++ Pb++ , соединений мышьяка объясняется образованием ковалентной связи фермента с ингибитором -> необратимое изменение конформации Химически модифицированный фермент ( неакт. )

Неконкурентное ингибирование 1. SH –групп ионами тяжелых металлов (Cu++, Hg++, As++, Pb++) 2. E – SH + Ag+ E – S – Ag + H + Активный Неактивный 3. 2. Агентами, связывающими Ме++, которые необходимы для активации фермента. 4. - цианиды образуют комплексы с Fe++, Fe+++ 5. - ЭДТА с Ме++ -> ингибирование ферментов 6. - тетрациклины связывают ионы Ме 7. 3. Синильная кислота, СО сязывают Fe++ в цитохромоксидазе

Неконкурентное ингибирование монотиоловых ферментов HCl - SH + - SH Cl Cl (Хлорвиниларсины) Акт. As – CH = CH - Cl НS-R -S As – CH = CH - Cl + -S Неактивен -S Неактивный Е НS-R R-S As – CH = CH - Cl + НS-CH 2 НS-CH НO-CH 2 As – CH = CH - Cl Люизит Реактивация Е: БАЛ -S SO 3 Na-CH 2 Унитиол 2 HS -

Конкурентное ингибирование Биоснтез ДНК, РНК Предшественники ТГФК Фолиевая кислота СУЛЬФАНИЛАМИД ТГФК Кофермент в биосинтезе пуринов и пиримидинов

Структуры основных ингибиторов Ахэ CH 3 O CH 3 – N – CH 2 – O – CH 3 Ацетилхолин CH 3 O CH 3 – N – CH 2 – O – C – NH 2 Карбаминоилхолин CH 3 O CH 3 C O C N H 3 C Прозерин CH 3 N+ H 3 C Ингибиторы обратимого типа CH 3 СH 3 CH - O - P = O CH 3 F Зарин ( образует продукт фосфорилирования АХЭ) O CH 3 – N – CH 2 – O – P - F CH 3 Метилфторфосфорилхолин ( исключительно сильное анти. ХЭ действие)

Аллостерическое ингибирование Аллостерический центр (НАДН 2, АТФ) + Vo I Е V max Vo EI - комплекс V max + 0 V max - V max К 0, 5 возрастает под действием отрицательного кодулятора [S] K 0, 5 [S] Vmax изменяется, а К 0, 5 почти const

Фосфатная модификация ферментов Е - ОН Активный фермент Протеинкиназа АТФ АДФ Е – О – РО 3 Н 2 Неактивный фермент

Ингибирование фермента путем ацетатной модификации PES - NH 2 + Простагландинэндопироксидсинтаза (ее циклогеназный компонент) O || Н 3 С-С-О COO- Аспирин (ацетилсалициловая кислота) O || Н 3 С-С PES - N COO+ НО Н Ацилированный фермент с блокированным центром Салициловая кислота