Лекция № 5 Кинетика ферментативного

Лекция № 5 Кинетика ферментативного катализа.

1. Методы определения количества ферментов 2. Наиболее часто используемые: 1) Колориметрические - основаны на определении образующихся в ходе реакции окрашенных веществ. Спектрофотометрические – основаны на поглощении света в определенных участках спектра субстратами и продуктами реакции, реже активными группами ферментов. Определение активности НАД – зависимых дегидрогеназ

2. Способы выражения активности ферментов. Используются 2 основные единицы: 1) КАТАЛ – такое количество фермента, которое может осуществить превращение 1 моль субстрата за 1 сек. 2) Катал = Моль/с, мк. Моль/с, н. Моль/с 3) 2) IU - International Units 4) МЕ( международная единица) – то количество любого фермента, которое катализирует превращение 1 мк. Моля субстрата в минуту при заданных условиях. 5) МЕ = мк. Моль / мин 6) Активность ферментов в сыворотке и плазме крови - в единицах на 1 литр : МЕ/л, Е/л 7) IU(МЕ) нкат/л К = 16, 67 8) 1 МЕ = 16, 67 нкат/л

3. Кинетика ферментативных реакций Ферментативная кинетика занимается исследованием закономерностей влияния химической природы реагирующих веществ (ферментов, субстратов) и условий их взаимодействия (концентрации, р. Н среды, температуры, присутствия активаторов или ингибиторов) на скорость ферментативной реакции. РАССМОТРИМ ФАКТОРЫ , КОТОРЫЕ ВЛИЯЮТ НА СКОРОСТЬ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ РЕАКЦИИ:

1) Зависимость скорости от вида субстрата. Ферменты обладают избирательностью действия - специфичность действия: 1 – Абсолютная специфичность. - фермент превращает только 1 субстарат. Стереохимическая специфичность – разновидность абсолютной. ( ЛДГ осуществляет превращение только L- лактата) 1) NH 2 NH 2 2) C = NH NH 2 (CH 2)3 аргиназа 3) NH C=O + CH – NH 2 4) (CH 2)3 NH 2 COOH 5) CH – NH 2 мочевина орнитин 6) COOH аргинин 7) NH 2 NH 2 Уреаза 8) С = O 2 NH 3 + CO 2 C=S 9) NH 2 тиомочевина

2 – Относительная специфичность ( объясняется тем, что, активный центр ферментов, обладаю- щих относительной специфичностью не жесткая структура, он может менять свою конформацию при образование E-S комплекса, и с каждым S эта конформация своя. )

2) Влияние [S] на скорость реакции. Теоретический график зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата при постоянной концентрации фермента. ( Михаэлиса – Ментен) V V max В) Б) V max / 2 V max х [S] А) Vo = [S] + Km [S] а) – реакция первого порядка (при [S] < Km скорость реакции пропорциональна [S]) б) – реакция смешанного порядка ( скорость пропор. конц. реаг. в-в) в) – реакция нулевого порядка ( высокая скорость , не зависящая от [S].

График Лайнуивера – Берка, построенный по методу двойных обратных величин. Наклон = Km / Vmax 1 / V 0 1 Km 1 = + 1/Vmax V V max x 1 V max S - 1 / Km 1 / [S]

4 Х Повышение концентрации 3) Зависимость V скорости реакции от концентрации 3 Х фермнета фермента. 2 Х 1 Х t, время 4) Зависимость скорости реакции от температуры.

4) Зависимость скорости реакции от р. Н среды. A Пепсин Амилаза Аргиназа 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 р. Н В норме р. Н цитозоля =7, 2 ФЕРМЕНТ Орt р. Н Пепсин 1, 5 Амилаза слюны 6, 8 – 7, 0 Трипсин 7, 7 Каталаза 7, 6 Уреаза 7, 0 – 7, 2 Липаза 7, 0 – 8, 5 Щелочная фосфатаза 10

A Область обратимой Область полной активации стабильности Активность ферментов при различных р. Н Денатурация пепсин трипсин 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 р. Н Ход ферментативной реакции во времени V I – переходный участок II – участок начальной скорости I III реакции в стационарной фазе III – участок основного протекания реакции t

Влияние различных веществ на активность ферментов 1. АКТИВАТОРЫ ФЕРМЕНТОВ 1. 1. Активация ферментов ионами металлов Ионы Mg+2, Mn+2, Zn+2, Co+2, K+ • Входят в состав простетической группы фермента, компонент активного центра • Облегчают образование ES - комплекса • Способствуют присоединению кофермента к апоферменту • Обеспечивают становление четвертичной структуры фермента • Действуют иными путями: - создание каталитически активной конформации белка - влияние на поверхностный заряд молекулы фермента - удаление ингибитора - вытеснение неэффективного иона из связи с ферментом

Механизм активации ферментов металлами 1. В состав активного центра: КА Н 2 О + СО 2 Н 2 СО 3 Zn: Е + Ме ЕМе + S EMe. S 2. Присоединение к субстрату: КФК АТФ + креатин креатинфосфат + АДФ Mg++ + АТФ Mg++АТФ Комплекс металл - субстрат Креатин + Mg++АТФ креатинфосфат + АДФ + Mg++

Регуляция ферментов анионами Cl Br Активность амилазы в присутствии различных ионов Обычные условия 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Активация ферментов 1) Ионами металлов 2) Восстановленными соединениями 3) S AH 2 ( NADH 2) SH 4) E E 5) S SH 6) неактивный активный 7) 3) Частичный протеолиз HCl 8) пепсиноген пепсин 9) пепсин 10)4) Аллостерическими активаторами ( АДФ, АМФ) 11)5) Гормонами через посредников: ц. АМФ, ц. ГМФ

Реакции ингибирования ферментативных процессов. ТИПЫ ИНГИБИРОВАНИЯ ФЕРМЕНТОВ I. Обратимое II. Необратимое Конкурентное Неконкурентное Бесконкуренетное Смешанного типа Для определения обратимости ингибирования проводят диализ среды, где есть фермент и ингибитор. Если после диализа восстанавливается активность фермента, то торможение - обратимое.

1. Конкурентный тип ингибирования Осуществляется веществом, близким по химическому строению к субстату. 1 / Vo [I] Vo V max Без ингибитора V max / 2 tg α = Km/ Vmax 1/ Vmax Km Ki [S] -1 / Km 1/[S] E + I EI ; K ing = [E] [ I ] / [ EI ]

2. Неконкурентное торможение Ингибитор реагирует с ферментом иным образом , чем субстрат, и поэтому повышение концентрации субстрата не может вытеснить ингибитор и восстановить активность фермента 1/V o Vo V max tg α = Km/ Vmax 1/ Vmax Km [S] - 1 / Km E + I EI ; ES + I ESI Km = const V max

3. Бесконкурентное торможение Ингибитор взаимодействует с фермент – субстратным комплексом. 1/V o [I] без ингибитора - 1 / Km I 2 1/ Vmax ES + I ESI Km Vmax - 1 / Km I 1 - 1 / Km 1/S 4. Смешанный тип торможения Ингибитор взаимодействует с ферментом в различных участках молекулы.

Ингибиторы взаимодействуют с ферментами различными путями, они могут: Блокировать активный центр фермента Менять четвертичную структуру фермента Блокировать часть фермента, соединяющуюся с коферментом, активатором Нарушать взаимодействие фермента с субстратом Соединяться с коферментом, активатором Вызывать денатурацию фермента (неспецифические ингибиторы) Связываться с аллостерическим центром

Классификация ингибиторов 6) Вызывающие ковалентную модификацию 1) специфические фермента: фосфатную, ацетатную 5) Аллостерические 2) неспецифические 3) Необратимого 4) Обратимого действия неконкурентные конкурентные

Ингибирование сериновых гидролаз (АХЭ) диизопропилфторфосфатом (ДФФ) ДФФ Остаток серина в активном центре Каталитически Сериновые протеиназы: неактивный эфир Химотрипсин, эластаза, тромбин, субтилизин

Необратимое ингибирование Йодацетамид Тиоловый (йодацетат) фермент Химически модифицированный фермент ( неакт. )

Необратимое ингибирование Трансацилаза –один из ферментов, участвующих в биосинтезе клеточной стенки бактерий. R = CO S NH (CH 3)2 - CH 2 OH + Пенициллин O= COO- N Трансацилаза Необратимое (активен) ингибирование Пенициллиноил – R = CO ферментный S NH (CH 3)2 комплекс (неактивен) - CH 2 O - С COO- НN O=

Необратимое ингибирование тиоловых ферментов • ТОКСИЧЕСКОЕ ДЕЙСТВИЕ Hg++ Химически Pb++ , соединений мышьяка модифицированный объясняется образованием фермент ( неакт. ) ковалентной связи фермента с ингибитором -> необратимое изменение конформации

Неконкурентное ингибирование 1. SH –групп ионами тяжелых металлов (Cu++, Hg++, As++, Pb++) 2. E – SH + Ag+ E – S – Ag + H + Активный Неактивный 3. 2. Агентами, связывающими Ме++, которые необходимы для активации фермента. 4. - цианиды образуют комплексы с Fe++, Fe+++ 5. - ЭДТА с Ме++ -> ингибирование ферментов 6. - тетрациклины связывают ионы Ме 7. 3. Синильная кислота, СО сязывают Fe++ в цитохромоксидазе

Неконкурентное ингибирование монотиоловых ферментов HCl - SH Cl -S + As – CH = CH - Cl - SH Cl Люизит -S Активный Е (хлорвиниларсины) Неактивный Е Реактивация Е: R-S НS-R As – CH = CH - Cl -S R-S As – CH = CH - Cl + 2 HS - - S Неактивен НS-R Активный Е НS-CH 2 НS-CH ; НS-CH + люизит CH 2 - S As – CH = CH - Cl НO-CH 2 SO 3 Na-CH 2 CH - S БАЛ Унитиол SO 3 Na-CH 2 Тиоарсенит (малотоксичен)

Конкурентное ингибирование Биоснтез ДНК, РНК Предшественники Фолиевая кислота ТГФК Кофермент в биосинтезе пуринов и пиримидинов СУЛЬФАНИЛАМИД

Структуры основных ингибиторов Ахэ CH 3 O CH 3 – N – CH 2 – O – CH 3 CH Ацетилхолин 3 CH 3 O СH 3 CH 3 – N – CH 2 – O – C – NH 2 CH - O - P = O Карбаминоилхолин CH 3 O CH 3 F CH 3 C O C N Зарин ( образует про- H 3 C N+ Прозерин CH 3 дукт фосфорили- H 3 C рования АХЭ) Ингибиторы обратимого типа CH 3 O CH 3 – N – CH 2 – O – P - F CH 3 Метилфторфосфорилхолин ( исключительно сильное анти. ХЭ действие)

Инактивация АХЭ

Реактивация АХЭ -I Пиридин-альдоксин-метил-йодид

Аллостерическое ингибирование Аллостерический центр + (НАДН 2, АТФ) Vo I EI - комплекс Е Vo V max V max + 0 - V max К 0, 5 [S] K 0, 5 [S] К 0, 5 возрастает под действием отрицательного кодулятора Vmax изменяется, а К 0, 5 почти const

Фосфатная модификация ферментов гликогенсинтаза Е - ОН Е – О – РО 3 Н 2 Активный Неактивный фермент АТФ АДФ фермент

Ингибирование фермента путем ацетатной модификации O || COO- Н 3 С-С COO- O || PES - NH 2 + Н 3 С-С-О PES - N + НО Простагландин- Н эндопироксид- Аспирин Ацилированный Салициловая синтаза (ацетилсалици- фермент с кислота (ее циклоге- ловая кислота) назный блокированным компонент) центром (неактивный фермент) Блокирование синтеза простагландинов – медиаторов воспаления Индометацин ингибирует PES иным путем – не путем ковалентной модификации фермента