Лекция 4 Макромолекулярная организация плазмалеммы Липидные рафты Механизмы

Лекция 4 Макромолекулярная организация плазмалеммы Липидные рафты Механизмы интернализации веществ клеткой (ЭНДОЦИТОЗ)

Жидкостно-мозаичная модель строения мембраны Пересмотр концепции строения плазматической мембраны Жидкостно-кристаллическая модель в «классическом» представлении не соответствует современным экспериментальным данным Эксперимент: В плазматической мембране фосфолипидный бислой неоднороден Липидные рафты – участки особого состава и строения в плазматической мембране, обогащенные холестеролом. Рафты более плотные, чем остальные области, и свободно перемещаются в окружающем пространстве (плоскости мембраны)

По данным моделирования: Рафты существуют в отдельной фазе, сходной с фазой организации липидов Lo Структура рафтов: асимметричный бислой, в котором сфинголипиды локализованы в наружном слое, а глицерофосфолипиды (типа фосфатидилсерина и фосфатидилэтаноламина) локализованы во внутреннем, цитоплазматическом слое, холестерол присутствует в обоих. Рафты существуют независимо от белков, и работают исключительно за счет взаимодействия липидов

сфингомиелин N-лигноцерил (C 24)-сфингомиелин и его бипроизводные Сфингозин - длинноцепочечная основа сфингомиелина. Очень длинный ацильный остаток (C-24) обеспечивает «непостоянство» длинной цепи, которая в отсутствие холестерола может участвовать в формировании бислоя. Любое изменение структуры молекулы сфингомиелина может привести к «включению» водородных связей и связыванию с холестеролом, что приведет к формированию «организованной» фазы липидов. Два слоя мембраны в области рафтов соединяются интердигитацией длинных Nацильных цепей сфинголипидов, в цитоплазматическом слое холестерол интеркалирован глицерофосфолипидами. Сфинголипиды и холестерол наружного листка бислоя играют критическую роль в формировании рафтов.

В 1997 году немецкий ученый Кай Зимонс выдвинул теорию «липидных рафтов» : липидная мембрана представляет собой динамичную, постоянно изменяющуюся среду, чутко реагирующую на все события, происходящие внутри и вокруг клетки. Липидные рафты были «узаконены» в 2006 г. на Keystone Symposium on Lipid Rafts and Cell Function: «Membrane rafts are small (10– 200 nm), heterogeneous, highly dynamic, sterol- and sphingolipid-enriched domains that compartmentalize cellular processes. Small rafts can sometimes be stabilized to form larger platforms through protein–protein and protein–lipid interactions» . Рафты - динамичные субмикроскопические ансамбли, свободно перемещающиеся в неупорядоченном липидном бислое мембраны, способные объединяться, формируя кластеры. С рафтами ассоциированы определенные классы белков. Многие вирусы используют рафты для проникновения в клетки.

подложка Мембрана, виден бислой Стрелками показаны сфингомиелиновые рафты Пики на снимке – «заякоренные» в рафтах белки Участки мембран клеток Атомно-силовая микроскопия

Функция липидных рафтов – пространственная концентрация специфических наборов белков для увеличения эффективности и специфичности передачи сигналов путем усиления взаимодействия между белками, и путем предупреждения перекреста между потоками сигналов и возникновения помех. Распределение гемагглютинина вируса гриппа на поверхности зараженной клетки. Микродомены (липидные рафты). Маркер рафтов – ганглиозид G 1 (гликозилфосфатидилинозитол)

Схема сортировки и концентрации белков липидными рафтами

Липидная асимметрия - неслучайное распределение различных видов липидов в бислое – общая черта мембран эукариотических клеток. Липидная асимметрия определяет различные биофизические свойства двух листков мембраны, и таким образом влияет на функции клеток. В основе липидной асимметрии лежат разные свойства липидов, составляющих мембрану, а также работа ферментов, переносящих липиды через бислой. Нарушение асимметрии играет важную роль в слиянии клеток, активации коагуляции крови, распознавании и удалении фрагментов клеток после апоптоза. Теория «липидного матрикса» - каждый белок в мембране окружен липидами, характер «окружения» варьирует.

A: Модель мембраны (Singer and Nicolson) – белки случайным образом распределены в гомогенном липидном бислое. B: Первоначальная гипотеза липидных рафтов – «платформы, плоты» высокоорганизованных липидов, обогащенных холестеролом, селективно связаны с белками. C: Современная модель гипотезы липидных рафтов включает взаимодействие рафтов с подлежащей кортикальной сетью актиновых филаментов.

Плоские рафты Мембрана – плоская. Изгиб (деформация) мембраны может вызываться разнообразными факторами и приводить к формированию пузырьков. Формирование пузырьков – фундаментальное свойство плазматической мембраны, обеспечивающее поступление в клетку самых различных веществ и их сортировку, рециркуляцию мембран, передачу сигналов и многие другие функции клетки, связанные с мембранами и обменом макромолекул. Изгиб мембраны (деформация) Деформация мембраны может быть опосредована (1) «покрытием» или (2) определенными мембранными доменами.

Установлено большое количество разнообразных молекул, участвующих в деформации мембран и формировании пузырьков Основные деформирующие мембрану белки высококонсервативны Клатрины – основной компонент клатрин-покрытых (опушенных, одетых) ямок (clathrin-coated pits) – есть в клетках дрожжей, растений и животных. Кавеолины – структурные маркеры кавеол, присутствуют в клетках позвоночных и беспозвоночных животных, и не найдены в клетках растений, дрожжей и амеб. Динамины – ГТФ-азы, участвующие в отделении пузырька от мембраны. Есть в клетках грибов, амеб, растений, животных. Очень вариабельны, различаются даже у разных млекопитающих. Формирование пузырьков (везикул) – основа ЭНДОЦИТОЗА Эндоцитоз – поступление в клетку всевозможных веществ, частиц, патогенов, рециркуляция мембран

Плазматическая мембрана – граница клетки с окружающей средой Термин «эндоцитоз» обобщает все пути поступления веществ в клетку, при которых формируется углубление плазматической мембраны и попадающее в клетку вещество ею окружается, формируется пузырек (везикула). Эндоцитоз является механизмом интернализации внеклеточных компонентов и фрагментов плазматической мембраны. Эндоцитоз многогранен и разнообразен Эндоцитоз контролирует состав плазмалеммы, определяет реакцию клетки на внешние воздействия, определяет изменения реакции и формы клетки, обеспечивает поступление фрагментов плазмалеммы и внеклеточных молекул внутрь клетки. Разновидности эндоцитоза выделяют по морфологии и размерам пузырьков, по участию тех или иных белков и липидов, по блокированию теми или иными веществами.

Разновидности эндоцитоза «МИКРОЭНДОЦИТОЗ» - интернализация мелких доменов 1. Клатрин-зависимый эндоцитоз 2. Кавеолин-зависимый эндоцитоз Клатрин- и кавеолин-независимые типы эндоцитоза (рафт-зависимые) 3. GPI-связанный эндоцитоз 4. Эндоцитоз рецептора интерлейкина 2β 5. Arf 6 –зависимый эндоцитоз 6. Флотиллин-зависимый эндоцитоз «МАКРОЭНДОЦИТОЗ» - интернализация крупных (мкм) доменов 7. Фагоцитоз 8. Макропиноцитоз 9. Эндоцитоз, связанный с циркулярными дорзальными складками (circular dorsal ruffles)

3 1 4 5 2 6 7 10 8 9

Клатрин-зависимый эндоцитоз Структура клатрина и три варианта его сборки in vitro. Клатрин Напыление платиной

Клатрин-зависимый эндоцитоз Рецептивный (рецепторно-зависимый) эндоцитоз Receptor-mediated endocytosis Стадии: Распознавание белковой молекулы (лиганда) рецептором Формирование лиганд-рецепторных комплексов Образование «опушенной» ямки (coated pit) Образование «опушенного» пузырька (coated vesicle) Отделение опушенного пузырька от плазмалеммы Формирование эндоцитозного пузырька Перенос лиганд-рецепторного комплекса в раннюю эндосому Процессинг лиганд-рецепторного комплекса, сортировка «Обработка» антигена «Клатриновый» транспорт – сортировка и доставка молекул между мембранными компартментами

5 – 7 минут Эндоцитозный пузырек Кластеры лиганд-рецептор «опушенная» ямка «опушенный» пузырек р. Н=5, 9 -6. Rabaptin-5 -GTP Ранняя эндосома

Клатрин-зависимый эндоцитоз Наночастицы золота Ранние эндосомы на ультратонких срезах и при негативном контрастировании

Клатрин-зависимый эндоцитоз Продолжительность: до 7 – 8 минут Частицы размером до 0, 2 -0, 25 мкм Белковые молекулы Вирусы Все типы клеток Антиген-презентирующие клетки

Кавеолин-зависимый эндоцитоз КАВЕОЛА – стационарная форма липидных рафтов Кавеолы – разновидность липидных рафтов, сферические или в форме фляжки углубления плазмалеммы, содержащие кавеолин-1. Диаметр кавеол - около 70 nm Количество кавеол: 10 – 80 кавеол на 1 мкм 2 Кавеолин-1 – маркер кавеол. Кавеолины-1; -2 и -3 Кавеолин-1 и -2 – в разных типах клеток, Кавеолин-3 – в основном в мышечных клетках

Работа ионных каналов, наряду с другими механизмами, регулируется липидными рафтами

Кавеолы на поверхности эндотелия А – D – замораживание – травление С, Е – ультратонкие срезы

Кавеолы Кластеры кавеол, рутениевый красный Кавеолы в мембране жировой клетки иммунофлуоресценция (фронтальный срез) Клетки эндотелия

Почкование вируса гриппа в связи с кавеолами

3 1 4 5 2 6 7 10 8 9

Клатрин- и кавеолин- независимые типы эндоцитоза Разновидности эндоцитоза, определенные по «молекулярным» характеристикам, нет «жестких» определений 3. GPI-опосредованный эндоцитоз. Гликозилфосфатидилинозитол - GPI Glycosylphosphatidylinositol anchor - GPI-linked proteins 4. Эндоцитоз рецептора интерлейкина-2 -β 5. Arf 6 –зависимый эндоцитоз Arf 6 = ADP-ribosylation factor 6. Небольшой гуаниннуклеотид-связывающий белок, стимулирует АДФрибозилтрансферазную активность холерного токсина. 6. Флотиллин-зависимый эндоцитоз

Морфологически клатрин- и кавеолин-независимые типы эндоцитоза либо пузырьки (везикулы), либо трубочки. Общее: Все эти типы эндоцитоза – клатрин- и кавеолин-независимые, считается, что они связаны с липидными рафтами Все вышеупомянутые типы эндоцитоза интернализуют микродомены плазматической мембраны

Плазмалемма Кавеолы Структуры клатрин- и кавеолин-независимого эндоцитоза

Эндоцитоз микродоменов плазматической мембраны - клатрин-зависимый -кавеолин-зависимый -клатрин-кавеолин-незаисимый Морфологически: пузырьки (везикулы) и трубочки Результат: эндоцитозный пузырек в цитоплазме Назначение: ранняя эндосома За час в среднем клетки могут интернализовать около 50% поверхности путем разных видов эндоцитоза Зачем клеткам такое количество вариантов микроэндоцитоза?

Типы эндоцитоза, связанные с интернализацией макродоменов плазматической мембраны Фагоцитоз «Самостоятельный» тип эндоцитоза – захват частиц из внеклеточного пространства Специализированные клетки- фагоциты «Профессиональные» фагоциты: макрофаги, нейтрофилы Уничтожение бактерий, фрагментов погибших клеток

Фагоцитоз

Фагоцитоз клеточного детрита Фагоцитоз сальмонелл

Макропиноцитоз Развивается около 1 мин. , захват больших объемов внеклеточной жидкости

Эндоцитоз, связанный с циркулярными дорзальными складками (circular dorsal ruffles)

Формирование складок связано с актином, контрактином, динамином 2, тирозин-киназами, и не связано с клатрином и кавеолином. Складки интернализуют большие массивы мембраны с рецепторами, связанными с тирозин-киназой. Складки – не макропиноцитоз, и не «простые» выросты цитоплазмы. Возникают однажды и существуют 10 -20 минут после стимуляции.

Энтоз Вариант эндоцитоза? ? Вариант клеточной гибели? Захват живой клетки соседней клеткой «клеточный каннибализм»

Эндоцитоз – очень широкое понятие В клетках млекопитающих сосуществуют разные типы эндоцитоза, не менее 10. Два больших класса эндоцитоза: - интернализация микродоменов плазмалеммы - интернализация крупных фрагментов плазмалеммы Типы (разновидности) эндоцитоза выделяют по зависимости от разных липидов и белков, включая клатрин, кавеолин-1, флотиллин, киназы, мелкие G белки, актин и динамин. В эндоцитоз вовлечено множество молекул и клеточных структур Все варианты эндоцитоза нуждаются в координированном взаимодействии широкого набора белков, обеспечивающих искривление мембраны, формирование углубления, отшнуровку эндоцитозного пузырька от плазмалеммы, взаимодействие с цитоскелетом.