ЛЕКЦИЯ 3 Репликация ДНК Организм Escherihia coli Arabidopsis

ЛЕКЦИЯ 3. Репликация ДНК Организм Escherihia coli Arabidopsis thaliana Saccharomyces cerevisiae Drosophila melanogaster Homo sapiens Triticum aestivum (гексаплоидная пшеница) Содержание ДНК (пн) (гаплоидный геном) 4, 2 · 106 4, 7 · 106 1, 4 · 107 1, 4 · 108 3, 3 · 109 1, 7 · 1010 Репликация или репликативный синтез ДНК – это процесс удвоения родительской молекулы ДНК. Это матричный синтез макромолекулы. Механизм химической реакции – перенос остатка дезоксирибонуклеозидмонофосфата (d. NMP) от дезоксирибонуклеозидтрифосфата (d. NTP) на концевой нуклеотидный остаток растущей нуклеотидной цепи.

Схема удвоения молекулы ДНК неорганическая пирофосфатаза Mg 2+ 3’ (активная высокоэнергетическая форма нуклеотида)

Модели репликации ДНК Родительские молекулы Первое поколение Второе поколение полуконсервативная дисперсионная

Опыт Мезельсона и Сталь Длительное время бактерии выращивали на среде, содержащей изотоп 15 N. Бактериальная клетка включила и состояла только из тяжелых изотопов 15 N. Затем клетки отмывали от питательной среды и переносили в новую, содержащую 14 N. Через несколько генераций выделяли ДНК и центрифугировали в градиенте плотности Cs Cl и Eth Br.

Опыт Мезельсона и Сталь Длительное время бактерии выращивали на среде, содержащей изотоп 15 N. Бактериальная клетка включила и состояла только из тяжелых изотопов 15 N. Затем клетки отмывали от питательной среды и переносили в новую, содержащую 14 N. Через несколько генераций выделяли ДНК и центрифугировали в градиенте плотности Cs Cl и Eth Br. Схема опыта

Реально наблюдаемая картина

Основные принципы репликации: • • Комплементарность; Антипараллельность и униполярность; Полуконсервативность; Потребность в затравке (ДНК-полимеразы; ДНКпраймаза); Репликативная вилка; Ассимитричность репликативной вилки, полунепрерывность; Бинаправленность, ori (сайт начала репликации); Расплетание дуплекса и разделение нитей с помощью белков (ДНК-топоизомеразы, ДНК-хеликаза, ДНКгираза, ssb-белки).

Репликативная вилка скорость: прокариоты – 500 н/с эукариоты - 50 н/с фрагмент Оказаки: прокариоты - 1000 -2000 н эукариоты - 100 -200 н праймер: прокариоты – 2 -5 н эукариоты - 5 -10 н рrimer - затравка

Направление репликации Репликоном называется участок ДНК, репликация которого протекает под контролем одного ori. англ. replication origin – ориджин (ori)

Репликативная вилка ДНК-праймаза ДНК-полимераза

Топоизомеразы Все топоизомеразы используют остаток тирозина активного центра фермента для нуклеофильной атаки фосфатной группы ДНК с образованием фосфотирозина. Топоизомеразы I – мономерные белки, релаксируют ДНК без затраты энергии - Топоизомеразы подтипа I-5’ (прокариоты) - Топоизомеразы подтипа I-3’ (эукариоты) Топоизомераза I человека (1 a 36 pdb, 591 АК) оборачивается вокруг ДНК и вносит разрыв, который позволяет спирали ДНК, вращаться и снимает напряжение. После релаксации, топоизомераза соединяет разорванные концы.

ДНК-топоизомеразы II – димеры (у эукариот) и тетрамеры (у прокариот); осуществляют АТФзависимое расщепление обеих нитей ДНК с образованием двух 5’-фосфодиэфирных связей с тирозином активного центра и с последующим переносом цепей через разрыв и его лигирование. ДНК-гираза (топоизомераза II) и топоизомераза IV эти ферменты выполняют строго определенные функции в процессе формирования пространственной структуры молекулы ДНК при ее репликации: ДНК-гираза катализирует расплетение (отрицательную суперспирализацию) нитей ДНК, а топоизомераза IV участвует в разъединении (декатенации) ковалентно-замкнутых кольцевых молекул ДНК.

ДНК-хеликаза Хеликаза – ДНК-зависимая АТФаза, использует энергию гидролиза АТФ для расплетания двойной спирали ДНК, имеет кольцевую (тороидальную) структуру, образованную шестью или четырьмя субъединицами (у E. coli известно 14 хеликаз, у эукариот – 24). Øвнешний – 12 -14 нм Ø внутренний – 2 -4 нм • Структура хеликазы Ruv. A кишечной палочки лат. helix - спираль

ssb- белки ssb-белки состоят из четырех идентичных субъединиц (тетрамер, 88 к. Да) -кооперативно связываются с он. ДНК; - стабилизируют он. ДНК; - обеспечивают условия для синтеза ДНК; -удаляют возможные элементы вторичной структуры ДНК; - стимулируют работу ДНК-полимеразы; - повышают точность работы ДНК-полимеразы. PDB: 1 SRU, ssb- proteins, E. coli ssb - single strand binding proteins – белки, связывающиеся с одноцепочечной ДНК

Механизм действия ДНК-лигазы 1. Реакция аденилирования ДНК-лигазы. Лигаза взаимодействует с высокоэнергетическим кофактором NAD+ (АТР у млекопитающих) с образованием аденилированной лигазы. 2. Реакция трансаденилирования. Затем лигаза активирует 5’-конец одного из фрагментов, аденилируя его. В процессе реакции высвобождается никотинамидмононуклеотид (пирофосфат). 3. Реакция лигирования. В результате нуклеофильной атаки 3’-концевой ОН-группы на ближайший фосфат образуется фосфодиэфирная связь, соединяющую два фрагмента ДНК, и освобождается АМР. Ligation- сшивание