Лекция 3 Ø 1. Методы изображения – – – Электронная микроскопия Зондовая микроскопия Оптическая микроскопия Ø 2. Методы структурного анализа – Дифракция рентгеновских лучей – Дифракция электронов Ø 3. Спектроскопия – – – • Инфракрасная спектроскопия Рамановская спектроскопия Флуоресцетная и люминесцентная Фотоэмиссионная (ФЭС, Оже, …) Магнитная (ЭПР, ЯМР) 4. Масс спектрометрия
Оптическая микроскопия • Классическая оптическая микроскопия (дальнего поля) • Конфокальная микроскопия (дальнего поля) • Микроскопия ближнего поля
Классификация оптических микроскопов по строению оптической схемы : - прямые микроскопы (объективы, наблюдательная насадка и окуляры расположены над объектом - инвертированные микроскопы (объект находится над оптической частью, формирующей изображение); - стереомикроскопы, содержащие в своей оптической схеме два расположенных под углом друг к другу микроскопа, формирующие объемное изображение объекта, объект располагается под оптической частью, формирующей изображение. -Эти три основных класса разделяются параллельно по двум схемам: по способам освещения; - проходящего сета - отраженного света, - по методам контраста. . - светлого поля, на светлом фоне выделяется более темный объект; - темного поля, на темном фоне выделяется светлый объект или его краевые cтруктуры; - фазового контраста, на светло-сером фоне наблюдается темно-серый рельефный объект. Объект практически всегда сильно оконтурен; - косого света, на относительно сером фоне наблюдается контрастное, более темное изображение с игрой светотени на контурах; - флуоресценции (люминесценции), на темном фоне выделяются светящиеся объекты или части объекта; - поляризованного света, наблюдается ярко окрашенное в различные цвета или оттенки изображение объекта; по областям применения • биология и медицина • материаловедение
Понятие светлого и темного поля Подавляющее большинство объектов, исследуемых под микроскопом, являются несамосветящимися; такие объекты следует освещать посторонним источником света. Роль освещения в передаче микроскопической структуры объекта с помощью микроскопа чрезвычайно велика. Устройство осветительной системы имеет большое практическое значение для получения контрастных и равномерно освещенных изображений. В микроскопе подвергаются исследованию главным образом две основные группы объектов: прозрачные (тонкие срезы, жидкости, тонкие шлифы минералов и т. п. ) и непрозрачные (травленые шлифы металлов, минералы руды и т. д. ). Соответственно этим группам объектов строятся осветительные устройства для проходящего и отраженного света. В микроскопических исследованиях широко пользуются освещением объектов по методу светлого и темного поля. Освещение объекта по методу светлого поля осуществляется посредством лучей, которые, выйдя из осветительной системы и пройдя прозрачный объект (проходящий свет) или отразившись от поверхности непроданного объекта (отраженный свет) по закону геометрической оптики, поступают в отверстие объектива, создавая изображения менее прозрачных элементов объекта в виде темных участков на светлом фоне. В случае отсутствии объекта поле зрения микроскопа кажется равномерно освещенным. Темное поле создается в тех случаях, когда в объектив микроскопа проходят лишь рассеянные (диффузно отраженные) от объекта лучи или лучи, отраженные элементами поверхности, имеющими надлежащий наклон по отношению к оптической оси объектива; вследствие этого картина в изображении кажется противоположной той, какая наблюдается при освещении на светлом поле: поверхность объекта представляется более или менее темной с ярко освещенными определенными деталями на ней.
На рисунке показаны схематически границы освещения объектов по методу светлого и темного поля в случае применения в микроскопе падающего и падающего света. Как видно из рисунка, освещение объектов по методу светлого поля можно осуществить, направив лучи в объектив микроскопа непосредственно снизу (проходящий свет) или сверху (отраженный свет). По методу темного поля непрозрачные объекты освещаются со стороны объектива лучами, идущими вне объектива, или лучами, направленными на прозрачный объект со стороны конденсора
Фазово-контрастная микроскопия используется для наблюдения прозрачных непоглощающих объектов, которые отличаются от окружающей среды показателями преломления или толщиной. Вследствие этого различия световая волна, прошедшая сквозь объект, претерпевает изменения по фазе и приобретает т. н. фазовый рельеф. Фазовые изменения, не воспринимаемые непосредственно глазом или фотопластинкой, с помощью спец. фазовой пластинки (фазового кольца) переводят в амплитудные изменения (амплитудный рельеф), воспринимаемые глазом как изменения интенсивности. Препарат 3 в фазово-контрастном микроскопе (рис. 5) освещается через кольцевую апертурную диафрагму 1, установленную в переднем фокусе конденсора 2. Изображение её получается в заднем фокусе объектива 4, где помещается прозрачная пластинка 5 с фазовым кольцом, размеры которого равны размерам изображения диафрагмы. Фазовое кольцо представляет собой вытравленную в пластинке канавку или нанесённую на неё тонкую плёнку. Регулярный свет, прошедший через фазовое кольцо, сдвигается по фазе на /2 (сплошные линии), а свет, дифрагировавший на объекте, не попадает в кольцо и не получает этого дополнит, сдвига по фазе (пунктирные линии). С учётом фазового сдвига, внесённого самим объектом, разность фаз между регулярной и дифрагировавшей волнами оказывается близкой к О или , и эти волны интерферируют. В результате в плоскости 6 формируется контрастное изображение объекта, в котором распределение освещённости приблизительно соответствует изменению показателя преломления (или толщины объекта). Метод фазового контраста в проходящем свете: 1 - апертурная диафрагма; 2 - конденсор; 3 - препарат; 4 - объектив; 5 - фазовая пластинка; 6 – изображение.
The most important concept underlying the design of a phase contrast microscope is the segregation of surround and diffracted wavefronts emerging from the specimen, which are projected onto different locations in the objective rear focal plane (the diffraction plane at the objective rear aperture). In addition, the amplitude of the surround (undeviated) light must be reduced and the phase advanced or retarded (by a quarter wavelength) in order to maximize differences in intensity between the specimen and background in the image plane. The mechanism for generating relative phase retardation is a two-step process, with the diffracted waves being retarded in phase by a quarter wavelength at the specimen, while the surround waves are advanced (or retarded) in phase by a phase plate positioned in or very near the objective rear focal plane. Only two specialized accessories are required to convert a brightfield microscope for phase contrast observation. A specially designed annular diaphragm, which is matched in diameter and optically conjugate to an internal phase plate residing in the objective rear focal plane, is placed in the condenser front focal plane.
При малой разности фаз в объекте регулярные и дифрагированные. лучи сильно отличаются друг от друга по амплитуде. Поэтому для повышения контраста на фазовое кольцо наносится дополнит, поглощающее покрытие. Метод фазового контраста широко используется при исследовании живых объектов, для которых окрашивание губительно. Он применяется также в отражённом свете для изучения микронеровностей, загрязнений, нарушений структуры на полированных металлических образцах.
Фазовый контраст: положительный отрицательный чешуя рыбы, увеличение 200 http: //www. microscopyu. com
Поляризационная микроскопия
D - дифрагированная волна S – окружающая (недифрагированная) волна РИзображения Векторные диагнраммы Фазовые соотношения между волнами Конфигурации фазовой пластины
With the use of crossed polarizers it is possible to deduce the permitted vibration direction of the light as it passes through the specimen, and with the first order retardation plate, a determination of the slow and fast vibration directions (Figure 7) can be ascertained. Under crossed polarizers, chrysotile displays pale interference colors, which are basically restricted to low order whites (Figure 7(a)). When a first order retardation plate is added (retardation value of one wavelength, or 530 -560 nanometers), the colors of the fiber are transformed. If the fiber is aligned Northwest-Southeast, the retardation plate is additive (white arrow in Figure 7(b)) and produces primarily yellow subtractive interference colors in the fiber. When the fiber is aligned Northeast-Southwest (Figure 7(c)), the plate is additive to produce a higher order blue tint to the fiber with no yellow hues. From this evidence it is possible to deduce that the slow vibration direction of the retardation plate (denoted by the white arrows in Figures 7(b) and 7(c)) is parallel with the long axis of the fiber. Amosite is similar in this respect.
Фазовый & поляризационный микроскоп Phyllite illuminated with plane-polarized light. Phyllite as imaged through crossed polarized illumination. Phyllite imaged with crossed polarizers and a full-wave (first order) retardation plate inserted between the specimen and analyzer.
К. Напольский, МГУ, хим. фак. 2006 Электрохимическое осаждение на 3 D ФК (полистирол-модифицированный)
Параллельные скрещенные поляризаторы Поле 50 х 80 мкм Объектив : Увеличение 63 NA: 0. 8 Улучшение параметров: Иммерсионный объектив До Ув. 100, NA 1. 45 Мишина-Расинг, Наймеген, 2006
Интерференционные микроскопы Когерентный фазовый микроскоп (КФМ) «Эйрискан» и метод Динамической Фазовой Микроскопии (В. П. Тычинский) Оптическая схема и внешний вид Когерентного Фазового Микроскопа «Эйрискан» .
Метод КФМ; (а) - представлена модель объекта находящегося в имерсионной среде; (б) - записанная топограмма с проведенным сечением, показывающим профиль измеряемого объекта.
Основные характеристики микроскопа Увеличение Общее увеличение M равно произведению увеличений объектива и окуляра: Гм = , где - расстояние от заднего фокуса объектива до переднего фокуса окуляра (т. н. оптическая длина тубуса), - фокусные расстояния объектива и окуляра. Обычно объективы имеют увеличения от 6, 3 до 100, а окуляры от 7 до 15; поэтому общее увеличение M. лежит в пределах от 44 до 1500. D = 250 мм - расстоянии наилучшего видения
Числовая апертура ЧА (numerical aperture NA) n – коэффициент преломления среды – угол полураствора конуса в котором сходится или расходится свет, который определяется диаметром линзы D и ее фокальным расстоянием F: Для удобства расчетов измеряют расстояние от оси в плоскости объекта в единицах длины волны света Безразмерная единица радиуса имеет вид А безразмерное расстояние вдоль оптической оси
Функция размытия точки (PSF) для линзы с фокальным расстоянием F от пучка ограниченного круглой диафрагмой диаметром D может быть выражено в общем виде: где – функции Бесселя k-го порядка, Картина дифракции на круглом отверстии имеет вид концентрических колец. Центральное светлое пятно носит название пятна Эйри. Интенсивность в максимуме первого светлого кольца составляет приблизительно 2 % от интенсивности в центре пятна Эйри.
Разрешающая способность микроскопа, критерий Релея. Под разрешающей способностью микроскопа обычно понимают возможность различения двух близких по интенсивности точечных объектов. Из вида функции распределения интенсивности в фокальной плоскости следует, что разрешение будет определяться степенью перекрытия пятен Эйри распределений двух точечных объектов. Релеем был предложен критерий, согласно которому две точки считаются разрешенными, если величина "провала" в интенсивности по центру между изображениями точек составили 26% от максимума. При этом расстояние между разрешаемыми точками должно быть больше радиуса пятна Эйри.
• Основная характеристика объективной линзы – ее числовая апертура, которая определяется диаметром оправы и фокусным расстоянием. • Разрешение обычного оптического микроскопа определяется дифракцией Фраунгофера на входной диафрагме объективной линзы. Минимальное расстояние между разрешаемыми точечными объектами одинаковой интенсивности равно радиусу пятна Эйри. • Функция размытия точки (или функции импульсного отклика дифракционно-ограниченной системы), которое будет использовано в дальнейшем при объяснении работы конфокального микроскопа.
Традиционные методы получения оптических изображений объектов имеют существенные ограничения, связанные с дифракцией света. Одним из основополагающих законов оптики является существование так называемого дифракционного предела, который устанавливает минимальный размер R объекта, изображение которого может быть построено оптической системой при использовании света с длиной волны : где n – показатель преломления среды. Для оптического диапазона длин волн предельный размер составляет величину порядка 200– 300 нм.
На пути к конфокальному микросокпу: увеличение контраста и разрешения . Ход лучей в обычном оптическом микроскопе, когда в фотоприемное устройство попадает свет из различных точек образца. При этом точки из плоскостей отличных от предметной будут создавать фоновую засветку, снижающую контрастность. Применение диафрагмы позволяет существенно снизить фоновую подсветку от точек образца вне анализируемой области.
Дополнительное повышение контраста достигается применением подсветки, фокусирующей свет в анализируемую точку. Схема со светоделительной пластинкой упрощает конструкцию микроскопа и процесс юстировки за счет двойного использования объектива (для подсветки и сбора отраженного сигнала).
Сравнение контраста d классическом и конфокальном микроскопах. в конфокальном микроскопе свет дважды проходит через объектив, то функция «классическая» размытия точки PSF Функция размытия точки PSF «классическая» PSF - вероятность того, что фотон попадет в точку с координатами ( , ) «конфокальная» PSF есть произведение независимых вероятностей. «конфокальная» PSF
Функции размытия точки для обычного микроскопа с диафрагмой размером 5 пятен Эйри (верхние рисунки) и для конфокального микроскопа (нижние рисунки)
Распределение интенсивности для случая обычного микроскопа (верхний рисунок) и конфокального микроскопа (нижний рисунок). Максимум интенсивности тусклого объекта в 200 раз меньше, чем интенсивность яркого.
Предел разрешения по критерию Рэлея конфокальный классический
Замечания по поводу разрешающей силы микроскопа Предел разрешения микроскопа (минимальное расстояние между 2 точечными источниками) составит: d = 0. 61 /NA. В литературе существуют неточности в определениях. Параметр d называют в разных изданиях: • пределом разрешения, • условием разрешения, • разрешением, • мерой РС • даже РС ! Между тем, РС – нечто положительное по смыслу. Чем больше РС – тем лучше, а d - чем меньше, тем лучше. Кроме того, d – это предел, а фактическая РС может быть хуже из-за ряда причин. Только в одном издании (Г. Ландсберг, «Оптика» ) дано четкое определение: d – условие разрешения, D = 1/ d - разрешающая сила, но для телескопа! Но эти определения можно применить и для микроскопа. Разрешающая сила будет тогда измеряться в 1/мкм, т. е. количество точек на микрон. Также, как и для качества печати принтера – dpi ( dots per inch ). Параметры разрешающей способности: Предел разрешения (латерального) d = 0. 61 / NA [мкм] Разрешающая сила (латеральная) D = NA / 0. 61 [ мкм-1 ]
Выводы. • Конфокальная микроскопия обеспечивает увеличение контраста изображения за счет применения подсветки сфокусированной объективной линзой в область анализа и размещения диафрагмы в плоскости наблюдения перед фотодетектором. Такое увеличение контрастности приводит к возможности разрешения объектов, имеющих разницу в интенсивности до 200: 1 • В конфокальной микроскопии несколько улучшается разрешение в плоскости объекта (в 1. 5 раза) и достигается высокое разрешение вдоль оптической оси. • Платой за полученные улучшения является необходимость применения схем сканирования, либо путем перемещения образца, либо путем перестройки оптической системы. Применение сканирования позволяет увеличить поле зрения по сравнению с обычными оптическими микроскопами.
http: //zeiss-campus. magnet. fsu. edu/tutorials/opticalsectioning/confocalwidefield/index. html
Пептидные трубки Изображение в двухфотонном микроскопе Изображение в обычном микроскопе
Сравнение изображений в классическом и конфокальном микроскопах http: //microscopy. fsu. edu/primer/virtual/ Описание конфокального микроскопа http: //www. ntmdt. ru/Download/5. 3. swf
Carl Zeiss «классический микроскоп» Разрешение – до 1 -2 мкм
Carl Zeiss Confocal Laser Scanning Microscope LSM 5 PASCAL Разрешение: до 100 нм
Примеры контрольных вопросов к лекции 3 • Нарисуйте ход лучей в микроскопе для получения изображения в светлом и темном полях • Что такое пятно Эйри? Что такое функция размытия точки? Проиллюстрируйте рисунком. • В каком из микроскопов – конфокальном или обычном- выше контраст изображения? Почему?
