Скачать презентацию Лекция 3 Метод замороженных срезов Иммуногистохимия Криоэлектронная микроскопия Скачать презентацию Лекция 3 Метод замороженных срезов Иммуногистохимия Криоэлектронная микроскопия

Рябчикова-лекция 3.ppt

  • Количество слайдов: 50

Лекция 3 Метод замороженных срезов Иммуногистохимия Криоэлектронная микроскопия Электронно-микроскопическая томография Атомно-силовая микроскопия Клетка Биомембраны Лекция 3 Метод замороженных срезов Иммуногистохимия Криоэлектронная микроскопия Электронно-микроскопическая томография Атомно-силовая микроскопия Клетка Биомембраны Плазматическая мембрана (плазмалемма)

Метод замороженных срезов Экспресс-диагностика Выявление ферментов Флуоресцентная иммуногистохимия Криостаты и замораживающие микротомы Микротом - Метод замороженных срезов Экспресс-диагностика Выявление ферментов Флуоресцентная иммуногистохимия Криостаты и замораживающие микротомы Микротом - криостат НМ 520 Leica LN 22 Замораживающий микротом на жидком азоте Замораживающий микротом Leica CM 1100 Сухая Портативный мобильный углекислота Криостат для рутинных работ, температура до -30°С

Гистохимическое выявление СДГ и НАДФНд На криостатных срезах мышцы Гистохимическое выявление СДГ и НАДФНд На криостатных срезах мышцы

ИММУННОМЕЧЕНИЕ Иммуноцитохимия – выявление антигенов в клетках Иммуногистохимия – выявление антигенов в тканях и ИММУННОМЕЧЕНИЕ Иммуноцитохимия – выявление антигенов в клетках Иммуногистохимия – выявление антигенов в тканях и органах Иммунофлуоресцентная микроскопия Позволяет быстро выявить антигены в культуре клеток и тканях Яркая картинка Не позволяет точно дифференцировать клетки Светооптическая иммуномикроскопия Позволяет одновременно изучать локализацию антигена и структуру ткани, патологические изменения Позволяет точно идентифицировать клетки Интенсивность и цвет окрашивания антигена зависит от применяемых реагентов

Суть любой иммуногистохимической реакции – визуализация комплекса антиген-антитело Прямой метод Фермент Антитело Антиген связывается Суть любой иммуногистохимической реакции – визуализация комплекса антиген-антитело Прямой метод Фермент Антитело Антиген связывается с антителом, которое конъюгировано с ферментом. В результате ферментативной реакции образуется окрашенный (видимый) продукт. Пероксидаза, кислая фосфатаза

Двойной непрямой метод Антиген фермент Антитела 1. Немеченые АТ связываются с АГ (первичные антитела). Двойной непрямой метод Антиген фермент Антитела 1. Немеченые АТ связываются с АГ (первичные антитела). 2. Меченые ферментом вторичные АТ связываются с первичными АТ (они теперь выступают в качестве антигена)

Тройной непрямой метод Антитела III Фермент Антитела II Антитела I Антиген Тройной непрямой метод Антитела III Фермент Антитела II Антитела I Антиген

Авидин-биотиновые методы Фермент Авидин Антитело II Биотин Антитело I Антиген Резко повышают чувствительность ИГХ Авидин-биотиновые методы Фермент Авидин Антитело II Биотин Антитело I Антиген Резко повышают чувствительность ИГХ реакции за счет высокой аффинности авидина (стрептавидина) к биотину. Авидин – белок, содержащийся в сырых куриных яйцах. Биотин – водорастворимый витамин Н (B 7), при биотинилировании ковалентно присоединяется к антителам

Негативная реакция На антигены ортопоксвирусов Печень мыши, Штамм ЕР-2 ВОК Позитивная реакция На антигены Негативная реакция На антигены ортопоксвирусов Печень мыши, Штамм ЕР-2 ВОК Позитивная реакция На антигены ортопоксвирусов Печень мыши Штамм К-2 Вируса эктромелии Иммунопероксидазная реакция Препараты И. В. Виноградова

ИММУННО-ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ Баланс между сохранением антигенной структуры и качеством фиксации - трудоемкий и дорогостоящий ИММУННО-ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ Баланс между сохранением антигенной структуры и качеством фиксации - трудоемкий и дорогостоящий метод - требует специальной быстрой фиксации и процедуры обезвоживания и заключения в заливочную среду - для каждого конкретного случая требуется подбор разведений первичных и вторичных антител - не все антитела, «работающие» в ИФА, «работают» в иммуно-электронной микроскопии - малая толщина срезов лимитирует интенсивность метки - отсутствие осмирования снижает качество изображения

Ферритин Коллоидное золото Ферритин Коллоидное золото

Криоэлектронная микроскопия Сохранность нативной структуры макромолекул в водной среде - замораживание образцов - витрификация Криоэлектронная микроскопия Сохранность нативной структуры макромолекул в водной среде - замораживание образцов - витрификация воды-льда - исследование в слое замороженной суспензии - криосрезы Leica EM HPM 100 Прибор для криофиксации путем заморозки под высоким давлением Получение изображений - устойчивость к воздействию электронного пучка и вакуума - повышение контраста

Процессор Leica EM AFS 2 Обеспечивает процесс замораживания-замещения и постепенного понижения температуры, полимеризацию заливочной Процессор Leica EM AFS 2 Обеспечивает процесс замораживания-замещения и постепенного понижения температуры, полимеризацию заливочной среды. Процессор Leica EM GP для Электронный микроскоп приготовления для криомикроскопии витрифицированных Tecnai G 2 20 S-TWIN. и очень тонких образцов. Образец замораживается в жидком этане, на сетке

Вирус гриппа Криопрепарат (в слое воды) Вирус гриппа Негативное Ультратонкий Контрастир-е срез Витрифицированный криосрез Вирус гриппа Криопрепарат (в слое воды) Вирус гриппа Негативное Ультратонкий Контрастир-е срез Витрифицированный криосрез Mycobacterium bovis

Электронно-микроскопическая томография Создание трехмерного изображения на основе последовательных снимков, сделанных под разным углом Специальный Электронно-микроскопическая томография Создание трехмерного изображения на основе последовательных снимков, сделанных под разным углом Специальный гониометр Требования к препарату Компьютерное обеспечение

Атомно-силовая Микроскопия Атомно-силовая Микроскопия

Атомно-силовая микроскопия Вирус осповакцины Живые бактерии в водной среде Атомно-силовая микроскопия Вирус осповакцины Живые бактерии в водной среде

Изображение химической структуры молекулы пентацена, состоящей из 22 атомов углерода и 14 атомов водорода. Изображение химической структуры молекулы пентацена, состоящей из 22 атомов углерода и 14 атомов водорода. Длина молекулы - 1, 4 нанометра, расстояние между соседними атомами углерода - 0, 14 нм. Получено специалистами из лаборатории IBM в Цюрихе методом бесконтактной атомно-силовой микроскопии. Микроскоп работал в сверхвысоком вакууме при - 268 °C. Необходимо было стабилизировать аппарат механически, так и термически, чтобы оба кончика AFM и молекула оставались в неизменном положении на протяжении более чем 20 часов.

Измерение силы взаимодействия между объектами Атомно-силовая спектроскопия Измерение силы взаимодействия между объектами Атомно-силовая спектроскопия

Выбор адекватного метода исследования – чрезвычайно важный момент, определяющий успех всего исследования И кто Выбор адекватного метода исследования – чрезвычайно важный момент, определяющий успех всего исследования И кто же это учил забивать гвозди микроскопом? ? !!

Клетка 1665 г. - Роберт Гук - открыл клетки, наблюдая срез пробкового дерева в Клетка 1665 г. - Роберт Гук - открыл клетки, наблюдая срез пробкового дерева в микроскоп, ввел понятие «клетка» от греч. «kytos» - полость «цитология»

История развития клеточной теории 1665 г - Роберт Гук: открыл клетки, ввел понятие История развития клеточной теории 1665 г - Роберт Гук: открыл клетки, ввел понятие "клетка" 1680 г – А. Левенгук: открыл одноклеточные организмы 1831 г - Роберт Броун: открыл ядро в клетке 1838 г - Матиас Шлейден: ядро - неотъемлемая часть растительной клетки 1839 г - Томас Шванн: ядро - неотъемлемая часть животной клетки 1858 г - Рудольф Вирхов: суть происхождения клетки - деление ("Omnis cellula ex cellula" = «Каждая клетка - из клетки» )

Современная клеточная теория: 1. Все живые организмы состоят из клеток. Клетка – наименьшая структурная Современная клеточная теория: 1. Все живые организмы состоят из клеток. Клетка – наименьшая структурная функциональная единица живого, основная единица строения и развития всех живых организмов; 2. Клетки всех одноклеточных и многоклеточных организмов сходны (гомологичны) по своему строению, химическому составу, основным проявлениям жизнедеятельности и обмену веществ. 3. Размножение клеток происходит путём их деления, и каждая новая клетка образуется в результате деления исходной клетки. 4. В многоклеточных организмах клетки специализированы по выполняемым ими функциям и образуют ткани; из тканей состоят органы. 5. Клеточное строение организмов – свидетельство, что все живые организмы имеют единое происхождение

Клетка – это Элементарная живая система, Способная к самообновлению, Саморегуляции и самовоспроизведению В природе Клетка – это Элементарная живая система, Способная к самообновлению, Саморегуляции и самовоспроизведению В природе НЕ СУЩЕСТВУЕТ «универсальной» клетки Наука «цитология» оперирует неким собирательным образом клетки Клеточные и неклеточные формы существования живой материи

Содержание в клетке химических соединений (в % на сырую массу) Вода 75 -85 Белки Содержание в клетке химических соединений (в % на сырую массу) Вода 75 -85 Белки 10 -20 Жиры 1 -5 Углеводы Нуклеиновые кислоты 0, 2 -2 1 -2 Низкомолекулярные органические соединения 0, 1 - 0, 5 Неорганические вещества 1 - 1, 5 Макромолекулярные соединения: углеводы, липиды, нуклеиновые кислоты, белки

Геном дрожжей кодирует около 6225 белков 17% их вовлечено в метаболизм, 30% обеспечивают организацию Геном дрожжей кодирует около 6225 белков 17% их вовлечено в метаболизм, 30% обеспечивают организацию клетки и биогенез органоидов, 10% участвуют в мембранном транспорте. В среднем каждого белка в клетке около 1 000 молекул Число молекул белков в гепатоците - около 7, 9 × 109

Первичная, вторичная, третичная и четвертичная структура белков Первичная, вторичная, третичная и четвертичная структура белков

Вторичная структура белков определяется водородными связями Неупорядоченная спираль – при отсутствии водородных связей α Вторичная структура белков определяется водородными связями Неупорядоченная спираль – при отсутствии водородных связей α спираль β слой Около 60% белков существуют в виде α- спирали, или β- слоя. Остальные – в виде неупорядоченных спиралей и изогнутых цепей в виде буквы U (шпилька).

Третичная структура белков. Определяется гидрофобными взаимодействиями между неполярными группами, и дисульфидными мостиками между аминокислотами. Третичная структура белков. Определяется гидрофобными взаимодействиями между неполярными группами, и дисульфидными мостиками между аминокислотами. Третичная структура является наивысшим уровнем организации для мономерных белков, состоящих из одной цепи. Мультимерные белки состоят из двух, или более цепей, или субъединиц, соединенных нековалентными связями. Четвертичная структура белков. Методы изучения: - рентгеноструктурный анализ - электронномикроскопическая томография Эпитопы – участки, на которые вырабатывается иммунный ответ. Кристаллы белков, выращенные в космосе

Протеасомы – пример сложной белковой структуры, когда компартментализация осуществляется без участия мембран. Функция протеасом Протеасомы – пример сложной белковой структуры, когда компартментализация осуществляется без участия мембран. Функция протеасом – деградация белков. Белки образуют различные комплексы с другими белками и другими молекулами Принципиально: существуют белки связанные с мембранами, и «свободные»

 «Биологическая» мембрана «Биологическая» мембрана

ФОСФОЛИПИДЫ (фосфоглицериды) – основная часть мембран. фосфатидилхолин фосфатидилэтаноламин фосфатидилсерин кардиолипин фосфатидилинозитол cфингомиелин ФОСФОЛИПИДЫ (фосфоглицериды) – основная часть мембран. фосфатидилхолин фосфатидилэтаноламин фосфатидилсерин кардиолипин фосфатидилинозитол cфингомиелин

Холестерол (холестерин) Молекулы холестерола ориентируются в бислое так, чтобы их гидроксильные группы примыкали к Холестерол (холестерин) Молекулы холестерола ориентируются в бислое так, чтобы их гидроксильные группы примыкали к полярным головам фосфолипидных молекул. При этом плоские стероидные кольца молекул холестерола частично иммобилизуют участки углеводородных цепей, непосредственно примыкающих к полярным головам.

Чистые фосфолипидные бислои спонтанно формируют замкнутые структуры, разграничивающие два водных компартмента. Пленки из фосфолипидных Чистые фосфолипидные бислои спонтанно формируют замкнутые структуры, разграничивающие два водных компартмента. Пленки из фосфолипидных бислоев нестабильны, тогда как замкнутые сферические структуры устойчивы Замкнутые фосфолипидные структуры - липосомы Сложные системы на основе липосом – экспериментальные модели для изучения транспорта через мембрану и пр. Асимметрия состава внутри и вне липосом Липосомы – транспортные системы – переносчики

Липосомы Негативное контрастирование Липосомы Негативное контрастирование

Липосомы Негативное контрастирование Липосомы Негативное контрастирование

Фосфолипидная мембрана – основа компартментализации живой материи, основа существования клетки Компартментализация – принцип пространственной Фосфолипидная мембрана – основа компартментализации живой материи, основа существования клетки Компартментализация – принцип пространственной организации клетки

В основе всех клеточных мембран - фосфолипидный бислой Мембраны всегда ограничивают замкнутое пространство Толщина В основе всех клеточных мембран - фосфолипидный бислой Мембраны всегда ограничивают замкнутое пространство Толщина клеточных мембран 6 --12 нм

В ЭМ мембраны имеют трехлинейное (трехконтурное) строение. Четырехокись осмия связывается с полярными группами фосфолипидов В ЭМ мембраны имеют трехлинейное (трехконтурное) строение. Четырехокись осмия связывается с полярными группами фосфолипидов по двойным связям, а гидрофобные концы молекул, формирующие светлую часть, не «окрашиваются» .

Скол мембран микроворсинок (быстрое замораживание-скалывание) Видны внутримембранные частицы. Скол мембран микроворсинок (быстрое замораживание-скалывание) Видны внутримембранные частицы.

Жидкостно-мозаичная модель строения мембраны Жидкостно-мозаичная модель строения мембраны

4 Цитоплазма 1 2 3 5 Способы «заякоривания» белков в мембране. 1. Монотопный белок, 4 Цитоплазма 1 2 3 5 Способы «заякоривания» белков в мембране. 1. Монотопный белок, а-спиральный домен которого пронизывает мембрану. 2. Политопный белок, пронизывающий мембрану несколько раз. 3. Белок, присоединенный к мембране через жирную кислоту. 4. Белок, присоединенный к мембране через жирную кислоту и углеводную молекулу 5. Периферические белки не имеют гидрофобных областей, но содержат заряженные части, взаимодействующие с другими белками или фосфатными группами фосфолипидов.

Гликофорин А содержится в мембранах эритроцитов, – первый изученный интегральный белок. Содержит 24 аминокислоты Гликофорин А содержится в мембранах эритроцитов, – первый изученный интегральный белок. Содержит 24 аминокислоты в а-спирали, которые формируют трансмембранный домен.

Бактериородопсин Бактериородопсин

Некоторые свойства клеточных мембран В мембранах в среднем на одну молекулу белка приходится 50 Некоторые свойства клеточных мембран В мембранах в среднем на одну молекулу белка приходится 50 молекул фосфолипидов, весовое соотношение – около 1: 1 Фосфолипиды и гликолипиды могут вращаться вокруг своей оси и перемещаться в латеральной плоскости. Средняя липидная молекула меняется местами с соседними около 107 раз в секунду, и перемещается за секунду на несколько мкм при 37 °C. Т. о. липидная молекула диффундирует по всей длине бактериальной клетки за 1 секунду, а по длине эукариотической клетки – за 20 сек. Липиды с ненасыщенными связями претерпевают фазовые переходы при более низких температурах, чем липиды с насыщенными связями. Гидрофобный внутренний слой мембран имеет небольшую вязкость и скорее жидкое, чем гелеобразное состояние. С уменьшением температуры, в мембранах повышается количество ненасыщенных жирных кислот – адаптация.

Функции клеточных мембран 1. Барьерная функция: создание концентрационных градиентов, препятствие свободной диффузии. Мембрана принимает Функции клеточных мембран 1. Барьерная функция: создание концентрационных градиентов, препятствие свободной диффузии. Мембрана принимает участие в механизмах электрогенеза: генерация потенциала покоя, потенциала действия, распространение биоэлектрических импульсов по однородной и неоднородной возбудимым структурам. 2. Регуляторная функция: тонкая регуляция внутриклеточного содержимого и внутриклеточных реакций путем рецепции внеклеточных биологически активных веществ, что приводит к изменению активности ферментных систем мембраны и к запуску механизмов вторичных «месенджеров» ( «посредников» ). 3. Преобразование внешних стимулов неэлектрической природы в электрические сигналы (в рецепторах). 4. Высвобождение нейромедиаторов в синаптических окончаниях.