Лекция 3 Аффинная хроматография Принципы и методы

Лекция № 3 Аффинная хроматография: Принципы и методы

Аффинная хроматография: вид адсорбционной хроматографии, основанный на взаимодействии с веществом, способным специфически связываться с выделяемым соединением и при этом связанным с твердым носителем неподвижной фазы. Такое вещество называется аффинным лигандом.

Аффинная хроматография в терминах кинетики L + LS S Стандартное определение равновесной константы диссоциации KD [L][S] KD = [LS] Конц. связ. вещества ~ L 0 ~ Общая конц. вещества KD + L 0 При связывании KD 10 -6 – 10 -4 M При элюции KD 10 -1 – 10 -2 M KD равновесная константа диссоциации комплекса [L] концентрация несвязанного лиганда [S] концентрация несвязанного вещества [LS] концентрация комплекса лиганд/вещество L 0 концентрация лиганда, обычно 10 -4 – 10 -2 M L+S LS LS L+S Изменение условий связывания и элюции меняет KD!

Аффинная хроматография в терминах кинетики L + S LS C+S KDComp = [C][S] [CS] CS KDComp равновесная константа диссоциации [C] концентрация несвязанного конкурентного лиганда [S] концентрация несвязанного вещества [CS] концентрация комплекса конкурентный лиганд/вещество Концентрация элюированного вещества Суммарная концентрация вещества ~ ~ ( r r+1 ) r. C 0 KDComp. L 0 r. C 0 + KD r : соотношение между объемом раствора конкур. лиганда и объемом пор матрицы, обычно находится в диапазоне 1– 10 KD : константа диссоциации вещества, связанного с лигандом на матрице C 0 : концентрация конкурирующего лиганда, обычно 10 -2 – 10 -1 M L 0 : концентрация лиганда на матрице, обычно 10 -4 – 10 -2

Процедура аффинной хроматографии 1) Аффинный сорбент уравновешивают буфером для связывания 2) На колонку наносят исходный препарат. Молекулы, обладающие сродством к лиганду, связываются с ним. Примеси удаляют промывкой. 3) Промывают колонку элюирующим буфером, нарушающим связывание между выделяемым веществом и лигандом поглощение Уравнове шивание Сорбция образца и элюция несвязанного вещества Отмывка примесей нанесение образца 1 -2 об. кол. Элюция Отмывка и связавшегося уравновешивание белка (ов) колонки Смена буфера x об. кол. объем 1 -2 cv >1 Об. кол. 1 -2 об. кол.

Способы элюции Способ элюции Особенности Изменение р. Н Изменение ионной (чаще повышение) Необходимо учитывать возможную нестабильность вещества или сорбента при экстремальных значениях р. Н. Можно собирать фракции в пробирки с нейтрализующим буфером. силы Подходит для крупномасштабной очистки биомакромолекул, так как соли дешевы и доступны в большом количестве Изменение температуры Позволяет получить препарат очищаемого вещества, не содержащий примесей: органических растворителей, солей и т. п. Добавки детергентов, хаотропных агентов, органических растворителей Денатурация очищаемого вещества не должна быть необратимой Элюция веществом, специфически взаимодействующим с лигандом или выделяемым веществом (частный случай – элюция свободным лигандом) Преимущество – специфичность элюции (пример: элюция белка lac-репрессора лактозой с колонки с иммобилизованной ДНК). Недостатки – лиганды обычно дороги и труднодоступны; возникает проблема разрушения комплекса макромолекулы с лигандом после элюции.

Способы элюции A элюция 280 A 280 линейное изменение условий элюции связывание Время/объем. Ступенчатая элюция Время/объем. Градиентная элюция

Носители для аффинной хроматографии Матрица: подходящая для присоединения лиганда. Должна быть физически и химически инертна. Спейсер: используется для улучшения связывания между лигандом и выделяемым веществом, для снятия стерических ограничений. Лиганд: молекула, которая обратимо связывается с выделяемым веществом или с группой веществ.

Требования к матрице • • 1) гидрофильность 2) крупнопористость 3) жесткость 4) устойчивость к физическим и химическим воздействиям • 5) наличие функциональных групп для иммобилизации лиганда • 6) отсутствие неспецифической сорбции разделяемых веществ на матрице Желательно, чтобы матрицу можно было получить в виде однородных по размеру сферических частиц

Типы матриц для аффинной хроматографии Матрицы на углеводородной основе: сфероны, Тойоперл Устойчивы к действию органических растворителей, высокой температуре и микробному разложению. Силикагель: прочен, устойчив к действию органических растворителей. Высокая скорость массопереноса. Поверхность модифицируют для повышения р. Н-стабильности и уменьшения неспецифической сорбции белков

Типы матриц для аффинной хроматографии Агароза (Sepharose): крупнопористая, достаточно жесткая и биологически инертная. р. Н-стабильность: 4 -9. Введение химических сшивок повышает устойчивость к мочевине и органическим растворителям ПААГ: непопулярен из-за недостаточной механической прочности. Прилипает к стеклу. Химическая модификация ПААГ H 2 N-(CH 2)2 -NH 2, 90°C -CONH 2 H 2 N-NH 2 -CO-NH-(CH 2)2 -NH 2 -CONH-NH 2 HNO 2 -CON 3 Ultrogel Ас. А: 2 – 4% ПААГ, укрепленный сеткой агарозы. Крупнопористый, жесткий, содержит два вида функциональных групп. Близок к агарозе по химической и термической стойкости.

Активация матриц Активация с помощью бромциана р. Н 10 -11

Активация матриц Активация с помощью карбонилдиимидазола

Активация матриц Активация дивинилсульфоном )-OH + CH 2=CH-SO 2 -CH=CH 2 )-O-CH 2 -SO 2 -CH=CH 2 + R-OH )-O-CH 2 -SO 2 -CH=CH 2 )-O-CH 2 -SO 2 -CH 2 -O-R

Активация матриц Активация с помощью бензохинона Активация с помощью трихлортриазина белок Реакция идет в мягких условиях, между лигандом и матрицей образуется прочная связь, но полученные сорбенты неспецифически связывают вещества, содержащие ароматические группы

Активация матриц Получение эпоксиактивированных сорбентов 1) 2)

Активация матриц Активация хлорангидридами сульфокислот Активация и присоединение лиганда происходят в мягких условиях Активированная матрица устойчива в течение длительного времени

Введение спейсера между лигандом и матрицей

Введение спейсера между лигандом и матрицей Спейсер не должен вступать в неспецифические взаимодействия с компонентами разделяемой смеси. Степень гидрофильности спейсера подбирают в зависимости от конкретной экспериментальной задачи L * * L L активированная матрица H 2 N-(CH 2)5 -COOH Сефароза-NH(CH 2)5 -COOH «CH-Сефароза» O Br. CN-или эпоксиактивированная сефароза H 2 N-(CH 2)6 -NH 2 Сефароза-NH(CH 2)6 -NH 2 «АН-сефароза» 1) карбодииимид 2) RCOOH 1) HO- N O 2) RNH 2 Сефароза-NH(CH 2)5 CONHR Сефароза-NH(CH 2)6 NHCOR

Условия присоединения лиганда Условия эксперимента Рекомендованные концентрации для иммобилизации лиганда Легко доступные лиганды 10– 100 кратный молярный избыток лиганда по отношению к группам на матрице Небольшие лиганды 1– 20 µмоль/мл матрицы (обычно 2 µмоль/мл смолы) Белковые лиганды 5– 10 мг белка/мл смолы Антитела 5 мг белка/мл матрицы Лиганды с низкой аффиностью Максимально возможная концентрация лиганда для улучшения связывания

Лиганды с групповой специфичностью Оптимальные значения КD комплекса лиганд-выделяемое вещество находятся в диапазоне 10 -4 – 10– 8 М Антибиотикициклопептиды (грамицидин, бацитрацин), продуцируемые некоторыми микроорганизмами, являются специфическими лигандами для протеиназ Структура бацитрацина

Лиганды с групповой специфичностью Освобождение от/очистка сериновых протеиназ OH OH Sepharose O O H N O NH N H Бензамидин-сефароза NH 2

Лиганды с групповой специфичностью Лиганды, содержащие остаток фенилборной кислоты, взаимодействуют с веществами, содержащими цис-диольные группировки

Лиганды с групповой специфичностью Гепарин Сульфированный глюкозаминогликан. MW 5 -30 к. Да Присоединяют к матрице восстановительным аминированием лиганд для ДНК- и РНК-связывающих белков, факторов свертывания крови , факторов роста, гиалуронидазы, липаз.

Хроматография на красителях Наиболее широко используется для NADзависимых ферментов, но можно очищать протеазы и другие белки, а также нуклеиновые кислоты Cibacron Blue (присоединяют триазиновым методом) – для промышленного получения сывороточного альбумина и интерферонаальфа Краситель Cibacron Blue Аденозинмонофосфат (через аминогруппу аденина) Red (Procion Red )Sepharose

Примеры белковых лигандов: 1) Белок А (из стафилококка) и белок G (из стрептококка) взаимодействуют с константной частью (тяжелыми цепями) иммуноглобулинов, а белок L-с легкими цепями каппа-типа. Эти белки применяют для очистки и нековалентной иммобилизации иммуноглобулинов Белки Gи. А Белок L Желтым цветом на рисунке показаны тяжелые цепи Ig, красным - легкие 2) Антитела – высокоселективные лиганды, но условия элюции в этом случае обычно жесткие.

3) Лектины – белки, специфически связывающие сахара и олигосахариды. Применяются для очистки полисахаридов, гликопротеинов и гликолипидов. Лектины Специфичность Лектины, связывающие маннозу/глюкозу Конкавалин А, Con A, Canavalia ensiformis Разветвленная манноза, другие углеводы с концевой маннозой или глюкозой (a. Man > a. Glc > Glc. NAc). Лентил Lectin, Lens culinaris Разветвленная манноза с остатками фукозы, связанной a (1, 6) связью с N-ацетил-глюкозамином, (a. Man >a. Glc > Glc. NAc). Лектины, связывающие N-ацетил-глюкозамин Лектин зародышей пшеницы, Triticum vulgare Хитобиозная основа из олигосахаридов, связанных через аминогруппы [Glc. NAc(b 1, 4 Glc. NAc)1– 2 >b. Glc. Nac]. Лиганды присоединяются бромциановым методом

Очистка биотина и биотинилированных белков Обычно используют стрептавидин-Sepharose, лиганд к смоле присоединяют гидроксисукцинимидным методом. Для модификации белков биотином (иминобиотином) используют его сукцинимидный эфир, реагирующий с аминогруппой лизина белок природа структура MW p. I Kd авидин гликопро тетрамер 66 -68 теин к. Да 10. 4 1. 3 × 10– 15 M at p. H 5 Стрепт Не тетрамер 60 к. Да авидин гликопро теин ~7

Метод «молекулярных отпечатков» Функционализованные мономеры Пороген Сшивающий агент полимеризация Молекулу- «шаблон» удаляют промывкой Молекулы «шаблоны» «отпечаток» используют для хроматографии

Аффинная хроматография рекомбинантных белков “tag” (англ. ) – ярлычок, бирка Аффинные тэги: Пептиды: His 4 -10 Кальмодулин-связывающий пептид FLAG-пептид (Asp-Tyr-Lys-(Asp)4 -Lys) Белки: GST (глутатион–Sтрансфераза) МВР (белок, связывающий мальтозу) Критерии выбора аффинного тэга: специфичность связывания тэга с аффинным лигандом, условия элюции с аффинного сорбента, влияние тэга на растворимость гибридного белка, величина нагрузки на метаболический аппарат клетки-хозяина, стабильность и цена аффинного сорбента

Связь, расщепляемая протеазой Клеточный экстракт Белок Гидролиз TEVпротеазой Белок TEV-протеиназа – протеиназа вируса гравировки табака (tobacco etch virus) IMAC – immobilized metal affinity chromatography, или металл-хелатная хроматография

Кальмодулинсвязывающий пептид Белок А примеси Изучение белковых комплексов с помощью тандемной аффинной очистки (TAP, tandem affinity purification) Пептид, расщепляемый TEVпротеазой TEV-протеаза – фермент вируса гравировки табака (tobacco etch virus) Гидролиз TEVпротеазой Элюция ЭГТА Сорбент с иммуноглобулином G Сорбент с кальмодулином Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln↓Gly

Преимущества аффинной хроматографии • 1) высокая избирательность, обеспечивающая возможность одностадийной очистки вещества в 100 и более раз • 2) связывание вещества с сорбентом происходит в мягких условиях, не угрожающих структуре (нативности) вещества • 3) высокий выход очищаемых веществ, обусловленный отделением гидролитических ферментов на первой стадии • 4) можно использовать большие объемы исходных препаратов; в ходе ступенчатой элюции происходит концентрирование

Металл-хелатная хроматография Меt: Cu, Zn, Ni, Со Иминодиуксусную кислоту присоединяют как через диэпоксиды, так и через эфиры. Для выделения фосфопротеинов используют Ga 3+ и Fe 3+ Преимущества: Разнообразие методов элюции Возможность работы как с нативными, так и с денатурированными белками Высокая емкость сорбента

Очистка и рефолдинг белка из телец включения за один шаг (His)6 фьюжн белок из E. coli на Ni 2+ Hi. Trap™ Chelating HP, 1 мл Нанесение образца A 280 Разбавление образца, промывка колонки 10 мл уравновешивающего буфера: 5 m. M имидазол, 6 M мочевина, p. H 8. 0 Нанесение образца и промывка колонки: 20 m. M имидазол, 6 M мочевина p. H 8. 0 1. 0 старт рефолдинга 0. 75 fr. fr. 38 40 42 0. 5 0. 25 fr. 46 fr. 49 Рефолдинг начало элюции Линейный градиент с 6 до 0 M мочевины в 30 объемах колонки Скорость потока: 0. 1 мл/мин до 1 мл/мин Промыть 5 мл буфера без мочевины Вручную используя шприц: • нанесение образца • Gua-HCl промывка • промывка мочевиной Очистка и элюция 0 10 20 30 40 50 60 65 мл Линейный градиент: от 20 m. M до 500 m. M имидазола в объеме от 10 до 20 объемов колонки

Металл-хелатная хроматография Простота применения Подготовить колонку Промыть H 2 O Заполнить Ni. SO 4 Промыть H 2 O 3 мин Уравновесить Нанести образец. колонку буфером Промыть буфером для связывания 3 мин Слив 5– 15 мин Слив Собрать Элюировать буфером для элюции 2 мин Собрать фракции

Ковалентная хроматография Выделение биомолекул со свободной SH-группой Sepharose N CH (CH 2)2 C NH CH CH 2 S S COOH O CO NHCH COOH O CH 2 CH CH 2 S S OH Sepharose N N 2 Активированная Тиол-Sepharose S S +RSH Активированная Тиопропил-Sepharose S S R+S N N H Восстан. агент Sepharose S S R Sepharose SH+R’ S S R’ Восстанавл. агент : низкомолекулярный тиол, напр. дитиотреитол RSH: вещество с SH-группой

Гидрофобная хроматография лизоцим химотрипсин Концентрация соли Желтым показаны гидрофобные остатки Рибонуклеаза А поглощение Цитохром с

Вот такие бывают колонки…

Различные хроматографические методы Гельфильтрация Ионо обменная Гидрофоб ная Аффинная Обращеннофазовая