Лекция 2 Молекулярная биотехнология Генетическая инженерия: молекулярные основы
1 Предмет, задачи, история возникновения генетической инженерии
Генетическая инженерия — совокупность приёмов, методов и технологий получения рекомбинантных РНК и ДНК, выделения генов из организма (клеток), осуществления манипуляций с генами и введения их в другие организмы. Рекомбинантные ДНК – молекулы ДНК, образованные путем соединения фрагментов ДНК, взятых от разных организмов. ?
Значение технологии рекомбинантных ДНК Научное познание живой материи: возможность получения генетического материала (количества вещества генов) для последующего изучения геномов живых организмов Управление живой материей на молекулярном уровне: • генетическая трансформация (модификация) живых организмов – получение животных, растений и микроорганизмов с заданными свойствами; • белковая инженерия – создание неприродных форм белков на основе видоизмененных генов
От открытия ДНК – к ДНК-технологиям 1871 г. – открытие ДНК Ф. Мишер выделил из изолированных ядер клеток гноя вещество, содержащее 14% азота и 2, 5% фосфора, которое по составу нельзя было отнести ни к какому классу известных в то время веществ. Мишер назвал это вещество «нуклеином» (от лат. нуклеус – ядро). Это был первый препарат, содержащий по современным оценкам до 30% ДНК Фридрих Мишер (1843 – 1895), швейцарский химик
1928 г. – Ф. Гриффитс, открытие генетической трансформации у пневмококков. Непатогенные Патогенные Фредерик Гриффитс (1881 – 1941) английский микробиолог
1944 г. , О. Эвери – доказательсво роли ДНК как носителя наследственной информации. Белок ДНК Культивирование с бескапсульным штаммом Освальд Эвери, американский биолог
1953 г. – Ф. Крик, Д. Уотсон, М. Уилкинс – открытие химической структуры ДНК
1960 - гг. – открытие рестриктаз – ферментов, разрезающих молекулу ДНК ( «молекулярные ножницы» ) Вернер Арбер швейцарский ученый молекулярный биолог Дэниэл На танс американский микробиолог и генетик. В 1978 г. присуждена Нобелевская премия по физиологии и медицине «за обнаружение рестрикционных ферментов и их применение в молекулярной генетике»
1972 -73 гг. - рождение генетической инженерии Пол Берг Создание первой рекомбинантной молекулы ДНК: вирус SV 40, бактериофаг λ и E. coli. Герберт Бойер Стенли Коэн Создание технологии клонирования изолированных генов в клетках бактерий в составе плазмид (векторов)
Секвенирование ДНК - расшифровка нуклеотидной последовательности ДНК Фредерик Сэнгер (США)
1985 г. - изобретение полимеразной цепной реакции (ПЦР) Карл Мюллис (США)
«Нуклеиновые кислоты в основе своей просты. Они лежат у истока самых фундаментальных биологических процессов роста и наследования. …» М. Вилкинс. Нобелевская лекция, 1962 г. 2 Строение и свойства ДНК
ДНК (дезоксирибонуклеиновая кислота) - биополимер, состоящий из мономерных молекул - нуклеотидов. В состав ДНК входят 4 типа нуклеотидов: аденозин H N N O О P О H N N O CH 2 O C C H H H C C ОH H тимидин CH 3 H O гуанозин О P O N О N H N N N O H О P O CH 2 O C C H О H H C C ОH H H O NH O CH 2 цитидин N O O C C H H H C C ОH H H N O О H P О O CH 2 O N O C C H H H C C ОH H H
Состав нуклеотида ( тимидин ) Кислород азотистое основание (тимин) Азот Водород O Фосфор CH 3 Углерод NH O О P О 5’ - фосфат O 5 CH 2 4 C H H C 3 ОH N O H C O 1 C 2 H 3’ - гидроксил 2’ - дезоксирибоза
Как образуется полимерная молекула? Молекула ДНК имеет несколько уровней структурной организации.
Первичная структура ДНК образуется за счет возникновения 3’, 5’-фосфодиэфирной связи между 3’-гидроксилом и 5’-фосфатом соседних нуклеотидов 5’конец O О P О H N N O CH 2 O H аденин Синтез цепи идет в направлении от 5’ к 3’ концу тимин C H H C C HO ОН ОО P О O 3 CH NH гуанин О О H 2 C N O O C H H C Н ОН О О N N O NH 2 P О 3’, 5’-фосфодиэфирная связь N H O тимин N C H C H O H C О ОН О P 2 CH O О O 3 CH NH О N H 2 O C H H C Н ОН 3’конец
H 3’ О P N H H CH 2 O О H 5’ N O P H N H C C H O О P О N H N О H C H H C образуется за счет водородных связей между комплементарными азотистыми основаниями : А=Т, Г=Ц H N N O Вторичная структура ДНК Т N А N N H О O N H H 2 O C H C C H H C H НO О P N О А CH 2 O C H H CH 3 C C C H O О P О H H О CH 2 O C H H C Т Н О H H N C H О N P О O O C H H C Г О CH 2 O О C H Н H C ОН H N CH 2 O А NH N N N O C C H O О P О NH N O CH 3 N CH 2 O O Ц N H О N N H Н O N H O CH 3 C H NH C H O О P О 5’ О N О CH 2 O Т C H H C C H Н ОН 3’
--Т А Ц Т А Т Ц А Т Г Г Т Т Г Г Г А Т Т Ц Г -3’ 5’ 5’ 3’ --А Т Г А Т А Г Т А Ц Ц А А Ц Ц Ц Т А А Г Ц-Взаимное расположение цепей в молекуле - антипараллельное
Двойная спираль ДНК – две антипараллельные цепи закручены вокруг продольной оси.
Размер молекулы ДНК измеряется числом пар нуклеотидов, за единицу измерения взята килобаза - тысяча пар нуклеотидов, или оснований (т. п. н. ). Молекулярная масса 1 т. п. н. ~ 6, 6· 105 ; длина – 340 нм. Escherichia coli - 4 · 106 п. н. , М = 2, 6 · 109, l = 1 мм; Drosophila melanogaster - l = 15 -16 мм Homo sapiens - l = 2 м!
Свойства ДНК
Денатурация - плавление ДНК, разрушение вторичной структуры молекулы ДНК вследствие разрыва водородных связей 5’ 5’ 3’ 3’ T=60… 900 C 3’ 3’ 5’ 5’
Ренатурация - отжиг ДНК, восстановление вторичной структуры вследствие образования водородных связей между комплементарными азотистыми основаниями 5’ 5’ 3’ 3’
Функции ДНК: Обеспечивает хранение наследственной информации о строении белков организма, зашифрованной в виде последовательности нуклеотидов в соответствии с генетическим кодом: ДНК ------Т А Ц Т Т Т А Ц А----транскрипция РНК ------А У Г А А А У Г У ----трансляция БЕЛОК метионин лизин цистин Экспрессия гена Ø
Ø Обеспечивает передачу наследственной информации дочерним молекулам (клеткам, организмам) в ходе репликации (самоудвоения) ----А Т Г А А А Т Г Т ----------Т А Ц Т Т Т А Ц А-----А Т Г А А А Т Г Т -----Т А Ц Т Т Т А Ц А----- репликация
3 Ферменты генетической инженерии
1. Рестриктазы (эндонуклеазы рестрикции) ферменты, расщепляющие фосфодиэфирную связь и разрезающие молекулу ДНК на отдельные фрагменты.
Рестриктазы открыты и выделены В. Арбером в 1962 г. в опытах по инфицированию бактериофагом λ штаммов Е. coli. От англ. restriction – ограничение. Фаговые бляшки Бактериальный газон Е. coli.
Номенклатура рестриктаз: при обозначении рестриктаз используют родовидовое название микроорганизма из которого выделен фермент: Escherichia coli Рестриктаза Вacillus Рестриктаза subtilis
Свойства рестриктаз: n Субстратная специфичность - способны распознавать определенную последовательность нуклеотидов на молекуле ДНК, в которой происходит разрыв – сайт узнавания, сайт рестрикции n Отсутствие видовой специфичности – расщепляют ДНК организмов разных видов
В генетической инженрии используются рестриктазы 2 -го класса – узнают последовательности, одинаково читаемые по обеим цепям – палиндромы. Разрыв молекулы ДНК происходит в сайте узнавания. Палиндромы – слова, одинаково читающиеся слева направо и справа налево НАГАН КАЗАК ШАЛАШ ОН ДИВЕН ПАЛИНДРОМ И НИ МОРД НИ ЛАП НЕ ВИДНО -- 5’ГАТЦ 3’ --- 3’ЦТАГ 5’ -- -- 5’ЦЦNNNГГ 3’ --- 3’ГГNNNЦЦ 5’ --- 5’АТТАЦГТААТ 3’ --- 3’ТААТГЦАТТА 5’ --
Характер расщепления сайта рестрикции Ø По оси симметрии – с образованием «тупых» концов -- 5’ АЦЦТЦТТАТТАЦГТААТТАТАЦЦЦТ 3’ --- 3’ Т ГГАГААТААТГ ЦАТТААТАТ ГГГА 5’ --
Ø Ступенчато – с образованием «липких» концов § с выступающими 5’- концами -- 5’ АЦЦТЦТТАТТ АЦГТААТТАТАЦЦЦТ 3’ --- 3’ Т ГГАГААТААТГЦАТТААТАТ ГГГА 5’ -- § с выступающими 3’- концами -- 5’ АЦЦТЦТТАТТ АЦГТААТТАТАЦЦЦТ 3’ --- 3’ Т ГГАГААТААТГЦАТТААТАТ ГГГА 5’ --
Некоторые рестриктазы 2 класса Микрорганизм-источник фермента Фермент Сайт рестрикции Escherichia coli Eco Г ↓ ААТТЦ Bacillus megaterium Bme ↓ ГАТЦ Metanococcus aeolicus Mae ↓ ГТNАЦ Thermus thermofilus Tth ГАЦN ↓ NNГТЦ Providencia stuarty Pst ЦТГЦА ↓ Г
Получение рестриктных фрагментов ЦАТТГТ ТТТ Г Г ААТТЦЦЦТЦААТГАТЦГТАГ ААТТЦАТЦГАТЦАТАЦЦЦАТГАААТАЦЦАТГАТЦААТГАА ГТААЦААААЦЦ ТТАА ГГГАГТТАЦТАГЦАТЦТТАА ГТАГЦТАГ ТАТГ Г ГТАЦТТТАТ ГГ ТАЦТАГТТАЦТТ Г↓ААТТЦ Eco ↓ ГАТЦ ЦАТТГТ ТТТ Г ГААТ Т ЦЦЦТЦААТ ГАТЦГТА Г ААТТЦАТЦГАТЦАТАЦЦЦАТГАААТА ЦЦАТ ГАТЦААТГАА ГТААЦААААЦЦ ТТАА Г Г ГАГТТА ЦТАГЦАТ Ц ТТААГТАГ ЦТАГ ТАТГ Г ГТАЦТТТАТ ГГ ТА ЦТАГТТАЦТТ Bme ↓ ГАТЦ Г↓ААТТЦ Eco + Bme ЦАТТГТ ТТТ Г Г ААТТЦЦЦТЦААТ ГАТЦГТА Г ААТТЦАТЦ ГАТЦАТАЦЦЦАТГАААТА ЦЦАТ ГАТЦААТГАА ГТААЦААААЦЦ ТТАА ГГГАГТТАЦТАГЦАТ ЦТТААГ ГТАГ ЦТАГ ТАТГ Г ГТАЦТТТАТ ГГ ТА ЦТАГТТАЦТТ
Разделение фрагментов электрофорезом Лунки с образцами ДНК Электрод Электрофорез – метод разделения биологических макромолекул (ДНК и белков) в электрическом Eco Bme Eco + Bme поле по их электрическому заряду, обусловленному Гелевая пластина размером молекулы. 30 20 10 Источник питания Ванна с электролитом
2. Экзонуклеазы – ферменты, гидролизующие фосфодиэфирную связь с 5’ или 3’ конца. Отщепляют от молекулы ДНК отдельные нуклеотиды. 3’ 5’ А Т 3’ Т А Ц Г Г Ц Т А А Т 5’
3. Лигазы – ферменты, катализирующие образование фосфодиэфирной связи и способствующие сшиванию разных фрагментов ДНК в единую молекулу.
4. ДНК-полимераза – фермент, катализирующий синтез полимерной молекулы ДНК на ДНК- матрице, способствующий репликации (удвоению) ДНК. 5’-3’ - экзонуклеаза 5’-3’ - полимераза 3’-5’ - экзонуклеаза
Для реакции полимеризации необходимы: n n ДНК – матрица Праймер (ДНК-затравка), комплементарный 3’-концу матрицы Свободные нуклеотиды Фермент ДНК-полимераза А Г 5’ 3’ А Т --Т А Ц Г Т А АА Т ЦЦЦТ ГТА --А Т Г Ц А Т Т Т А Г Г ГАЦАТ-3’ 5’
5. Обратная транскриптаза (ревертаза) – фермент, катализируюший синтез ДНК на РНК-матрице. ДНК, синтезированная таким образом называется комплементарной (к-ДНК)). Прокариоты Эукариоты Геномная ДНК оче интрон пре-м-РНК т кор нов арио нтро эук ит и ДНК одерж рная не с ента тм-РНК лем НК, . к. Комп ой Д омн ген к-ДНК экзон
6. Терминальная трансфераза – фермент, присоединяющий к 3’-концу ДНК отдельные нуклеотиды. 3′ ГГГГГ 5′ 5′ 3′ Гомополимерный липкий конец ГГГГГ
4 Методы создания рекомбинантных ДНК
1. Коннекторный метод (от англ. to connect – соединять) – основан на использовании терминальной трансферазы, синтезирующей на соединяемых фрагментах взаимокомплементарные липкие концы. • вырезание рестриктазами фрагментов ДНК; • синтез взаимокомплементарных концов на фрагментах ДНК; • взамодействие концов за счет водородных связей; • сшивание лигазой; • заделывание брешей ДНК-полимеразой
АААААА 3 ′ Схема коннекторного метода 3′ 5 ′ 3 ′ ТТТТТ 5′ ААА 5′ 3′ 3′ 5′ Т ТТАА ТТ А АА 5′ 3′ ТТ ТТТТ 3′ АААААА 5′ ТТТТ
2. Рестриктазно-лигазный метод – основан на использовании рестриктаз, образующих у разрезаемых фрагментов ДНК липкие концы. • вырезание одной и той же рестриктазой фрагментов ДНК с комплементарными липкими концами; • соединение липких концов за счет водородных связей; • сшивание лигазой, образование фосфодиэфирной связи;
Схема рестриктазно-лигазного метода АТТАААТЦГ ААТТЦААТЦТАТГ ААТТЦААТГТ ААТТЦ ТААТТТАГЦТТАА ГТТАГАТАЦТТАА ГТТАЦА Eco АТТАААТЦГААТТЦААТГТ ААТТЦ ТААТТТАГЦТТААГТТАЦА
Если невозможно выделить разные фрагменты ДНК одной и той же рестриктазой, используется линкер. Линкеры (от англ. link – звено (цепи), соединять) короткие синтетические фрагменты ДНК, содержащие сайты узнавания какой-либо рестриктазы.
Схема использования линкера АТТАААТЦГ ААТТЦААТЦТАТГ ААТТЦААТГТ ААТТЦ ТААТТТАГЦТТАА ГТТАГАТАЦТТАА ГТТАЦА Eco АТГ ААТТЦТА ААТТЦ ТА Alu ЦТТАА ГАТ Линкер АТГ ААТТЦТА ААТТЦ ТАЦТТАА ГАТ АТТАААТЦТЦ ГАААТГТТАЦТГТЦ ГАААТГТТ ГА ГА ТААТТТАГАГ ЦТТТАЦААТГАЦАГ ЦТТТАЦАА ЦТ ЦТ Eco
Варианты конфигурации рекомбинантных ДНК Линейная Кольцевая Восьмерки и петли
Конец
Скачать презентацию Лекция 2 Молекулярная биотехнология Генетическая инженерия молекулярные основы
Лекция 2_Генетическая инженери Строение ДНК.ppt