Лекция 14 Хроматография Основы метода и ключевые параметры

Лекция 14 Хроматография Основы метода и ключевые параметры

План лекции n n n Определение хроматографии и история метода Причины широкого распространения хроматографии в современной аналитической химии Классификация хроматографических методов Основные понятия и параметры Достоинства метода

Михаил Семенович Цвет

Этапы развития хроматографии 1903 г. Открытие хроматографии (Цвет М. С. ) 1938 г. Тонкослойная или планарная хр-фия (Измайлов Н. А. , Шрайберг М. С. ) 1941 г. Жидкостная распределительная хр-фия (Martin A. D. P. , Synge R. L. M. ) 1952 г. Газовая распределительная хр-фия (Martin A. D. P. , James A. ) 1956 г. Капиллярная газовая хр-фия (Golay M. ) 1975 г. Ионная хроматография (Small H. , Stevens T. S. , Bauman W. W. )

Число публикаций Года

В чем причины? n n Создание новых веществ, типов лекарств, красителей и т. п. Расширение списка контролируемых соединений Снижение ПДК вредных веществ Развитие науки и техники

Процесс разделения Учитывает природу вещества, подвижной и неподвижной фаз, условия распределения Коэффициент распределения D (или K) = С 1 / C 2 Фаза 1

Процесс разделения

Хроматография Гибридный аналитический метод, основанный на дифференцированном многократном распределении компонентов в системе из двух фаз подвижной и неподвижной.

Процесс разделения Сорбат Элюент Элюат Сорбент

Хроматограмма апельсинового сока > 50 веществ / < 30 минут

Классификация хроматографических методов анализа • По агрегатному состоянию подв. фазы • По механизму разделения • По технике исполнения • По целям и задачам • По способу перемещения сорбата • По способу детектирования (газовая, жидкостная) (распределительная, адсорбционная, ионообменная, эксклюзионная и др. ) (колоночная, планарная и др. ) (аналитическая, препаративная) (элюентная, вытеснительная, фронтальная) (прямой, косвенный)

Классификация по агрегатному состоянию фаз 1. Сначала классифицируют подвижную фазу Газ Сверхкритический флюид Жидкость 2. Затем классифицируют неподвижную фазу Тв. тело Газотвердофазная (газоадсорбционная) Жидкость Тв. тело Жидкость Жидкостнотвердофазная (жидкостная) Газожидкостная Жидкостножидкостная

Элюент Классификация по способу перемещения сорбата Элюентный вариант C В А Сигнал детектора B A C Время, мин

D Классификация по способу перемещения сорбата Вытеснительный вариант C B A D Сигнал детектора В А С D Время, мин

Фронтальный вариант Сигнал детектора C В А Классификация по способу перемещения сорбата В А+В+С А+В А С А Время, мин

Классификация по целям и задачам Аналитическая Задача разделения и определения веществ (малых количеств) Малый объем вводимой пробы, Элюентный вариант хр-фии и т. д. Препаративная Задача выделения веществ (больших количеств) Большой объем вводимой пробы, Вытеснительный или фронтальный варианты хр-фии и т. д.

Классификация по технике исполнения Колоночная Планарная (плосткостная)

Аналитические и препаративные колонки 5 -25 см

Принципы прямого и косвенного детектирования Прямое Косвенное Аналитический сигнал дает определяемое вещество, сигнал элюента принимается нулевым Аналитический сигнал дает элюент, сигнал определяемого в-ва значительно меньше

Отклик детектора Хроматограмма Параметры • Временн. Ые • Детектирования Время

Мертвое время (t 0) Отклик детектора • Время выхода неудерживаемого компонента • Время нахождения компонентов в подвижной фазе • Обычно стараются минимизировать • На хр-ме определяется мертвое время ВСЕЙ системы, а не колонки t 0 Время

Время удерживания (t. R) (retention time) • Легко определяется из хроматограммы • Интуитивно понятно Отклик детектора • Зависит от конструкции системы и скорости потока элюента • Не может быть адекватной характеристикой при сравнении хроматограмм t 0 t 1 t 2 t 3 Время

Исправленное время удерживания ’) ( t. R • t’x = tx – t 0 Отклик детектора • Определяет время нахождения компонента в НЕПОДВИЖНОЙ фазе (ts) • Не зависит от конструкции системы t 0 t 1 t 2 t 3 Время

Удерживаемый объем (Vx) 1 хроматограмма: F = 1 мл/мин t 0 = 2 мин t 1 = 5 мин 2 хроматограмма: F = 0. 5 мл/мин t 0 = 4 мин t 1 = 10 мин • V’x = t’x * F • V’x = Vx – V 0 • Не зависит от скорости потока подвижной фазы

Коэффициент емкости К (фактор удерживания) Коэффициент емкости К = (tx-t 0) / t 0 - отношение исправленного времени удерживания к мертвому времени Этот параметр не зависит от размеров колонки, и широко используется в хроматографической литературе и расчетах. Однако, зависит от фазового отношения (следовательно, плотности набивки колонки).

Относительное удерживание (или селективность) A B t 0 t’A BA = t’B / t’A t BA > 1 t’B Cелективность — это способность хроматографической системы разделять данную пару веществ А и B.

Размывание зоны компонента Теоретическая форма пика Реальная форма пика

Теория теоретических тарелок Высота эквивалентная теоретической тарелке (ВЭТТ) H Соответствует высоте слоя сорбента, при прохождении которой акт сорбции—десорбции успевает совершиться в среднем один раз. N = L / H ВЭТТ Отражает качество использованного сорбента и заполнения колонки.

Эффективность колонки и ширина пика t. R W h 0. 607 h 0. 5 W 0. 5 h W 2

Кинетическая теория размывания Скорость перемещения по колонке отдельных молекул отличается от средней скорости, характерной для данного соединения • Неоднородность потока подвижной фазы. • Продольная диффузия в неподвижной и подвижной фазах • Кинетика массопередачи в неподвижной и подвижной фазах • Неравновесность процесса внутри застойных зон

Кинетическая теория размывания Эффективность зависит от: • Диаметра зерен сорбента, их геометрии и монодисперсности • Качества набивки колонки • Мертвого объема системы • Скорости потока элюента

Уравнение Ван-Деемтера ВЭТТ = A + B/u + Cu А– h Вихревая диффузия B/u – Молекулярная диффузия Cu – Сопротивление C массопереносу B uопт A u

Оптимальные скорости потока элюента Колонки с диаметром 3, 4, 4. 6 мм 0. 8 -2. 5 мл/мин Колонки с диаметром 1. 5, 2 мм 0. 2 - 1. 0 мл/мин

ВЭЖХ при ультравысоких давлениях Колонка: 43 см х 30 мкм Сорбент: 1 мкм Давление: 7100 атм Максимальная эффективность: 625000 теор. т. /м Вес установки ~ 7 тонн J. W. Jorgenson et al. LC-GC, 2003.

Влияние удерживания (К), селективности ( ) и эффективности (N) на разделение K=5 = 1. 2 N = 10 000 K=5 = 1. 7 N = 400 K = 0. 5 = 1. 4 N = 15 000

Критерий разделения Rs Rs 0. 7 W 1 W 2 • Продолжает увеличиваться при увеличении времени второго пика и уже полном разрешении

Факторы, улучшающие разрешение пиков • • • Увеличение длины колонки Уменьшение внутреннего диаметра колонки Оптимальная скорость потока элюента Однородность сорбента, его сферичность Однородность набивки колонки Уменьшение обьема вводимой пробы Правильный выбор подвижной фазы Использование градиентного элюирования Правильный выбор неподвижной фазы

Количественный анализ в хроматографии S • Количественной характеристикой является высота или площадь пика • При наличии маленьких или несимметричных пиков предпочтительнее использовать h расчет по площадям пиков • Если отклик детектора для всех определяемых веществ одинаков, можно использовать метод внутренней нормировки (сумма площадей всех пиков = 100%) • метод внутреннего стандарта • метод добавок

Чувствительность и предел обнаружения Чувствительность – определяется наклоном градуировочного графика H пика Предел обнаружения – наименьшее содержание, при котором компонент можно обнаружить с заданной вероятностью по данной методике H пика H шума ) S = d. H/d. C С, мг/л H пика = 3 * H шума

Основные преимущества ВЭЖХ n n n n Высочайшая селективность Надежность результатов КХА Многокомпонентность анализа Низкие пределы обнаружения (0. 1 мкг/л) Широкий диапазон линейности (1 -1000 мкг/л) Малый расход пробы (1 мл) Экспрессность анализа Простота эксплуатации и возможность полной автоматизации

Сравнительная характеристика методов