Лекция 12 Использование методов генной инженерии в селекции

Лекция 12. Использование методов генной инженерии в селекции растений

В настоящий момент наиболее популярным методом переноса генетического материала в геном пшеницы является метод баллистической трансформации. В последние годы на станции искусственного климата «Биотрон» (Филиал Института биоорганической химии РАН, Пущино) ведутся работы по разработке эффективной системы соматического эмбриогенеза/генетической трансформации различных яровых и озимых сортов пшеницы Российской селекции.

Генная пушка (Gene Gun)

Векторы для генетической трансформации пшеницы Для получения трансгенных растений пшеницы используется векторные конструкции для экспрессии гетерологичных генов в геномах злаковых культур (Рис): p. Act 1 -F и ps. GFP-BAR. Первая векторная конструкция содержит репортерный ген gus (является модифицированным геном из Escherichia coli, кодирующим β-глюкуронидазу с молекулярной массой 68 к. Д). Вторая конструкция содержит ген gfp, который контролирует синтез GFP-белка (green fluorescent protein). Этот ген был выделен из ДНК медузы Acquorea victoria.

Трансгенные растения с этим геном светятся в ультрафиолете зеленым светом. Кроме того вектор содержит оптимизированный кодон для экспрессии в растениях, а также ген bar (синоним PАТ-ген), придающий устойчивость растений к гербициду Basta (содержит L-phosphinotricin). Для достижения высокой экспрессии данных генов используют промоторы+интроны Ubi 1 кукурузы и Act 1 риса. Экспрессия перенесенных генов в различных тканях пшеницы. A. GUS экспрессия в сегментах стебля и зачаточном колосе. B. Экспрессия гена gfp в молодом колосе. C. Экспрессия гена gfp в пыльниках (верхний пыльник – нетрансгенный).

Agrobacterium tumifaciens — это бактерия, паразитирующая на растениях. В цитоплазме паразита содержится Ti — плазмида, в которой находится Т-ДНК, способная проникать в растительную клетку и встраиваться в ее геном, а также vir-гены, ответственные за осуществление этого процесса. Т-ДНК содержит гены синтеза необычных аминокислот и углеводов (опинов), которыми питается агробактерия, а также гены фитогормонов, индуцирующих опухолевое разрастание растительных тканей. Рецепторы на поверхности бактериальной клетки реагируют на продукты распада растительной клеточной стенки, в результате чего активируются virгены, продукты которых осуществляют репликацию и перенос Т-ДНК в клетку-реципиент.

Агробактериальная трансформация широко используется в генетической инженерии растений, однако чаще используют так называемую бинарную векторную систему, состоящую из плазмиды, содержащей Т-ДНК, в которой гены синтеза опинов и фитогормонов заменены на целевой трансген, и из отдельной плазмиды-хелпера, несущей только vir-гены.

Трансгенные и контрольные растения сахарной свёклы (Beta vulgaris L. ) после обработки гербицидом BASTA

РАТ-ген (ген bar) кодирует синтез фермента фосфинотрицин ацетилтрансферазы. Синтетический bar-ген соответствует РАТ-протеину грибка Streptomices viridochromogenes и обеспечивает устойчивость растения к глюфосинату путем специфического N-ацетилирования гербицида в растительной клетке. Для получения устойчивых к гербицидам сортов сахарной свёклы bar ген переносится в растительный геном с помощью вектора в состав которого входит генетический материал широко используемых в генетической инженерии плазмид p. RK 290 и p. OCA 18/Ac от бактерии E. coli и Тi плазмиды от Agrobacterium tumefaciens.

Для экспрессии bar-гена используют 35 S промотор (последовательность ДНК, обеспечивающая посадку РНК-полимеразы) и терминатор (последовательность нуклеотидов ДНК, узнаваемая РНК-полимеразой как сигнал к прекращению синтеза молекулы РНК и диссоциации транскрипционного комплекса) – от вируса мозаики цветной капусты (Ca. MV). РНК-полимеразой обычно называют ДНК-зависимые РНК-полимеразы, осуществляющие синтез молекул РНК на матрице ДНК, то есть осуществляющие транскрипцию.

Процесс агробактериальной трансформации

Для отбора трансформантов используется маркерный ген NPT II – ген, кодирующий синтез фермента неомицинфосфотрансферазы и придающий устойчивость к антибиотикам канамицину и неомицину. Для экспрессии NPT II гена необходим NOS/OCS промотор и терминатор из бактерии Agrobacterium tumefaciens. Таким путём например создан устойчивый к гербицидам сорт сахарной свёклы Edda. ГИО проявляет устойчивость при обработке растений гербицидом в концентрациях до 1500 г д. в. /га, исходный сорт погибает при концентрациях 300 -1000 г д. в. /га. Устойчивость к гербициду проявляется во всех частях облиственного растения, за исключением пыльцы.

Линия 40 -3 -2 устойчивая к глифосату MONSANTO, USA (1999)

Фирма Монса нто (Monsanto, Сент-Луис, шт. Миссури) — мировой лидер поставок ГМ-сои. В 1996 году Монсанто выпустила на рынок генетически изменённую сою с новым признаком Roundup Ready или сокращённо RR, что означает «Готовая к Раунда пу» . «Раунд ап» — это торговая марка гербицида под названием глифосат, который был изобретён и выпущен на рынок Монсанто в 70 -х годах. Roundup Ready растения содержат полную копию гена енолпирувилшикиматфосфат синтетазы (EPSP synthase) из почвенной бактерии Agrobacterium sp. strain CP 4, перенесённую в геном сои при помощи генной пушки (Gene Gun), что делает их устойчивыми к гербициду глифосату, применяемому во всём мире для борьбы с сорными растениями.

Трансгенные растения картофеля, устойчивые к колорадскому жуку Контрольные растения картофеля, уничтоженные колорадским жуком

Бактерия Bacillus thuringiensis, продуцирует белокдельта-эндотоксин или CRY-белок, являющийся очень токсичным для многих видов насекомых, в то же время безопасный для млекопитающих. Встраивание гена этого белка в геном растений дает возможность получить трансгенные растения картофеля, не поедаемые колорадским жуком. В настоящее время так называемые Bt-растения (от В. thuringiensis) хлопка и кукурузы занимают основную долю в общем объеме генетически модифицированных растений этих культур.