Лекция № 12 Биохимия нуклеиновых кислот. Матричные биосинтезы.
План лекции: 1. 2. 3. 4. 5. Структура и функции ДНК (закономерности нуклеотидного состава, структура, гистоны, укладка ДНК в хроматине). Репликация ДНК (механизмы, ферменты). Повреждения ДНК. Репарация повреждений и ошибок репликации (механизы, ферменты). Структура и функции РНК (разновидности, структура). Биосинтез РНК и ее процессинг. Обмен нуклеотидов (состав, биосинтез, катаболизм). Нарушение обмена азотистых оснований (подагра). Биосинтез белков. Аминокислотный код. Этапы трансляции (подготовительный, элонгация, пострибосомная трансформация полипептидной цепи). Ингибиторы трансляции. www. themegallery. com
1. Структура и функции ДНК (закономерности нуклеотидного состава, структура, гистоны, укладка ДНК в хроматине). L/O/G/O
РНК и ДНК • В клетке имеются два типа нуклеиновых кислот: рибонуклеиновая кислота (РНК) и дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК). И ДНК, и РНК – полимерные цепочки, состоящие из отдельных звеньев – нуклеотидов. www. themegallery. com
Первичная структура ДНК Первичную структуру ДНК составляет последовательность нуклеотидов в полинуклеотидной цепи. Молекула ДНК состоит из 4 видов нуклеотидов.
Вторичная структура ДНК • Основу цепочек ДНК составляет «сахаро-фосфатный остов» – остатки дезоксирибозы, соединенные через остатки фосфорной кислоты. В этой цепочке азотистое основание присоединено к первому углеродному атому дезоксирибозы, «свой» фосфат – к пятому, а по третьему атому данное нуклеотидное звено соединяется с фосфатом другого звена • Молекула ДНК представляет собой две цепочки нуклеотидов, спирально закрученные вокруг общей оси. Азотистые основания двух цепочек располагаются друг напротив друга перпендикулярно оси спирали. На один виток спирали приходится 10 пар азотистых оснований, диаметр спирали составляет 2, 37 нанометра. www. themegallery. com
Функция ДНК • Главная функция ДНК – хранение генетической информации: гены представляют собой участки молекул ДНК, в которых хранится информация обо всех белках и РНК организма. Изменения в структуре ДНК называются мутациями. РНК выполняет в клетке несколько важных функций, связанных с синтезом белка. • Основные свойства молекул ДНК и РНК. Нуклеиновая кислота Азотистые основания Моносахарид Кол-во цепочек ДНК Аденин Гуанин Цитозин Тимин дезоксирибоза 2 РНК Аденин Гуанин Цитозин Урацил рибоза 1 www. themegallery. com
Комплементарность • Цепочки ДНК удерживаются в двойной спирали благодаря водородным связям между азотистыми основаниями, в состав которых входят атомы кислорода и азота с частично отрицательным зарядом, а также атомы водорода, на которых имеется частичный положительный заряд. Благодаря электростатическому притяжению могут возникать связи между азотистыми основаниями, причем отнюдь не между любыми из них. Полностью подходящими будут пары «аденин–тимин» и «гуанин– цитозин» . Такое строгое соответствие оснований одной и другой цепочки получило название комплементарности (дополнительности). Пара «аденин– тимин» соединяется двумя водородными связями, а пара «гуанинцитозин» – тремя. При повышении температуры раствора происходит денатурация ДНК – двойная спираль расплетается на отдельные цепочки. www. themegallery. com
2. Репликация ДНК (механизмы, ферменты). Повреждения ДНК. Репарация повреждений и ошибок репликации (механизмы, ферменты). L/O/G/O
• Реплика ция (от лат. replicatio — возобновление) — процесс синтеза дочерней молекулы дезоксирибонуклеиновой кислоты на матрице родительской молекулы ДНК. В ходе последующего деления материнской клетки каждая дочерняя клетка получает по одной копии молекулы ДНК, которая является идентичной ДНК исходной материнской клетки. • Этот процесс обеспечивает точную передачу генетической информации из поколения в поколение. • Репликацию ДНК осуществляет сложный ферментный комплекс, состоящий из 15 -20 различных белков, называемый реплисомой. www. themegallery. com
УСЛОВИЯ ДЛЯ РЕПЛИКАЦИИ 1. Достаточное количество дезоксирибонуклеотидов (д ATФ, д. TTФ, д ГTФ, д ЦTФ) 2. Расплетение двойной спирали ДНК 3. Образование затравки (праймера (РНК) 4. Наличие необходимых ферментов www. themegallery. com
Стадии репликации ДНК Процесс репликации состоит из: 1. инициации (начало процесса) 2. элонгации (собственно синтез, удлинение, приращение) 3. терминации (окончание процесса) www. themegallery. com
Репликация ДНК Стадия инициации • Репликация ДНК всегда идет от 5’– конца нити ДНК (то есть содержащего 5’дезоксинуклеотидную группу) к 3’-концу (то содержащему свободную 3 -ОН-группу) и нуждается в наличии ранее синтезированного фрагмета нити ДНК в качестве затравки для реакции полимеризации. Такой ДНК-фрагмент, имеющий свободный 3’-конец, называется праймером. • Ферменты, катализирующие праймерзависимую, детерминируемую ДНК-матрицей реакцию присоединения дезоксинуклеотидов, называются ДНК-полимеразами. www. themegallery. com
Репликация ДНК Стадия инициации • Точки начала репликации на молекуле ДНК имеют специфическую последовательность оснований, богатую парами А -Т. Процесс начинается с того, что с каждой такой последовательностью связываются несколько молекул специальных узнающих белков (у прокариот это белки Dna. A). • Первым начинает действовать фермент геликаза (от helix - спираль). Он обеспечивает расплетение двойной спирали родительской ДНК путем разрыва водородных связей между нуклеотидами. На это затрачивается энергия гидролиза АТФ – по две молекулы на разделение 1 пары нуклеотидов. У эукариот одновременно происходит вытеснение данного участка ДНК из связи с гистонами и другими хромосомными белками. www. themegallery. com
Репликация ДНК Стадия инициации • • Однако расплетение спирали на некотором участке создает суперспирализацию перед этим участком, так каждая молекула ДНК некоторыми участками зафиксирована на ядерном матриксе. Поэтому она не может свободно вращаться при какого-то своего участка. Это и вызывает суперспирализацию, что препятствует дальнейшему расплетению цепи. Эта проблема решается с помощью ферментов топоизомераз. Существует два типа топоизомераз (топоизомераза типа I и топоизомераза типа II). Топоизомераза I разрывает одну из цепей ДНК, и переносит один свободный конец на себя. Это позволяет участку ДНК от места расплетения до места разрыва вращаться вокруг целой цепи, что предупреждает образование супервитков. Впоследствии концы разорванной цепи вновь замыкаются. Топоизомераза II разрывает обе цепи ДНК, перенося соответствующие концы на себя. Это позволяет более эффективно решать проблему суперспирализации при расплетении ДНК. После расплетения двойной спирали хеликазой, с каждой из двух нитей связываются специальные SSB-белки. Они обладают повышенным сродством к одноцепочечным участкам ДНК и стабилизируют их в таком состоянии. Механизм действия основных ферментов репликации ДНК-полимераз таков, что синтез новой полинуклеотидной цепи не может начаться с включения в нее первого нуклеотида. Синтез идет только как удлинение уже существующего полинуклеотида, который комплементарен матрице и образует с ней двуспиральный комплекс матрица-затравка. Во всех живых системах такой затравкой служит не ДНК, а короткая РНК-затравка www. themegallery. com синтезируется ферментом праймазой (или РНК-полимеразой).
Вилка репликации • По мере движения вилки одновременно должны синтезироваться две дочерние цепи. Вилка движется в направлении от 5' к 3’ на одной цепи и от 3’ к 5' – на другой. Однако нуклеиновые кислоты синтезируются только от 5'– к 3'-концу. Проблема решается таким образом, что на одной из родительских нитей новая нить синтезируется непрерывно в направлении 5'-3', что совпадает с движением вилки репликации. Это называется лидирующей или ведущей. Другая нить называется отстающей или запаздывающей, так как синтез на ней идет с некоторой задержкой по сравнению с лидирующей нитью. Это связано с тем, что ДНК на этой нити синтезируется также от 5' к 3', но в направлении, противоположном движению вилки, и короткими фрагментами. Благодаря этому разнонаправленный синтез ДНК может осуществляться в рамках одной структуры – репликативной вилки. www. themegallery. com
Репликация ДНК Стадия элонгации • На этой стадии осуществляется синтез цепей ДНК. Каждый нуклеотид включается в цепь лишь в случае его комплементарности нуклеотиду, занимающему данную позицию в составе матрицы. Ферментный комплекс функционирует так, что одна из двух цепей растет с некоторым опережением по сравнению с другой цепью. Соответственно, первая цепь называется лидирующей, а вторая – запаздывающей. Важнейшее обстоятельство состоит в том, что лидирующая цепь образуется в виде непрерывного очень длинного фрагмента. Запаздывающая цепь образуется в виде серии относительно коротких фрагментов – примерно по 1500 нуклеотидов. Это т. н. фрагменты Оказаки. В виде фрагментов Оказаки синтезируется та цепь, направление образования которой противоположно направлению движения соответствующей репликативной вилки. Рост цепей ДНК осуществляется ферментами ДНК-полимеразами. Удлиннение цепи ДНК (или отдельного ее фрагмента) всегда происходит в направлении от 5’-конца к 3’-концу. Это означает, что очередной новый нуклеотид присоединяется к 3’-концу растущей цепи. www. themegallery. com
Ферменты стадии элонгации • Элонгацию обеих полинуклеотидных цепей ДНК катализирует фермент δ ДНКполимераза. • Кроме собственно фермента, в репликативный комплекс входят белки RFC - Replication Factor C и PCNA - Proliferating Cell Nuclear Antigen. Первый блокирует наращивание РНК-праймера на 3'-конце сверх требуемой длины. Второй играет роль «прищепки» или зажима, крепящего δ ДНКполимеразу к реплицируемой полинуклеотидной цепи. www. themegallery. com
ЭЛОНГАЦИЯ РЕПЛИКАЦИИ РНК-праймер Лидирующая ДНК-полимераза δ SSB-белки ДНК полимераза ε узнает РНК праймер и начинает синтезировать ДНК Фрагменты Оказаки Отстающая ДНК-хеликаза РНК-праймер Праймаза (ДНК-полимераза α) РНК-праймер
Для завершения репликации (стадия терминации) используются ферменты ДНК-лигаза и теломераза. • В результате действия предыдущих ферментов новосинтезированная запаздывающая цепь оказывается состоящей из фрагментов, вплотную примыкающих друг к другу (кроме кольцевой ДНК). «Сшивание» соседних фрагментов осуществляется ДНК-лигазой (фермент образует фосфодиэфирную связь). Для осуществления реакции требуется гидролиз АТФ. • ДНК-полимеразная система оставляет недореплицированными 3’-концы материнских цепей ДНК, т. е. новые цепи оказываются укороченными с 5’-концов. В каждой новой цепи фрагмент Оказаки, находящейся у 5’конца, как и обычно, начинается с короткой РНК-затравки (у 5’-конца лидирующей цепи тоже находится РНК-затравка). РНК-затравки удаляются специальной нуклеазой. Но застроиться дезоксинуклеотидами образующаяся «брешь» не может, поскольку ДНК-полимеразы не способны действовоать «с нуля» , а лишь удлиняют 3’-конец уже имеющегося полинуклеотида. Поэтому получается, что новая цепь должна быть короче старой. Эта проблема решается при помощи фермента теломеразы. Теломераза удлинняет не новую, укороченную цепь, а старую, более длинную. К 3’-концу старой (родительской) цепи теломераза последовательно пристраивает несколько сотен повторяющихся последовательнотей. После чего значительно удлинненная старая цепь становиться способной выступать в качестве матрицы для образования еще одного фрагмента Оказаки новой www. themegallery. com (укороченной) цепи.
3. Структура и функции РНК (разновидности, структура). L/O/G/O Биосинтез РНК и ее процессинг.
Типы РНК В биосинтезе белков в эукариотических клетках задействованы три типа РНК: 1. рибосомные, или р. РНК (РНКполимеразы I), 2. информационная (матричная), или и(м)РНК (РНК-полимеразы II), 3. транспортная или т. РНК (РНКполимеразы III). www. themegallery. com
Транскрипция РНК • Транскри пция (от лат. transcriptio — переписывание) — процесс синтеза РНК с использованием ДНК в качестве матрицы, происходящий во всех живых клетках. Другими словами, это перенос генетической информации с ДНК на РНК. www. themegallery. com
Транскрипция катализируется ферментом ДНК-зависимой РНК-полимеразой. Соответственно, в этих клетках имеется три РНК-полимеразы I, II и III. РНКполимераза I участвует в синтезе молекулы-предшественницы пре-р. РНК, РНК-полимераза II - ключевой фермент в транскрипции структурных (смысловых) генов, кодирующих аминокислотные последовательности белков, а также нуклеотидные последовательности sno. PHK и некоторых sn. RNA (англ. small nuclear RNA или малых ядерных РНК). РНК-полимераза III участвует в транскрипции генов т. РНК, некоторых sn. RNA и других преимущественно низкомолекулярных видов РНК. Отдельные РНК-полимеразы эукариот различают «свои» промоторы, чем объясняется транскрибирование ими разных видов РНК. www. themegallery. com
Что необходимо для транскрипции 1. Цепь ДНК – матрица 2. Ферменты (РНК-полимераза) 3. Свободные дезоксирибонуклеозидфосфаты (АТФ, УТФ, ГТФ, ЦТФ). www. themegallery. com
Стадии транскрипции РНК Процесс транскрипции состоит из: 1. инициации (начало процесса) 2. элонгации (собственно синтез, удлинение, приращение) 3. терминации (окончание процесса) www. themegallery. com
Стадия инициации • «Активация» промотора происходит с помощью белка, который получил название ТАТАфактора, потому что он взаимодействует со специфической последовательностью нуклеотидов промотора -ТАТА-. • ТАТА-фактор облегчает взаимодействие промотора с РНК-полимеразой. Связывание РНК-полимеразы с промотором увеличивает сродство фермента к факторам инициации (А, В), которые обеспечивают раскручивание примерно одного витка двойной спирали ДНК.
Стадии транскрипции www. themegallery. com
Стадии транскрипции 1. присоединение в область промотора белка, который называется «ТАТА-фактор» ; 2. включение РНК-полимеразы в промоторный участок, при этом в зоне присоединения РНК-полимеразы происходит локальное расплетение двойной спирали ДНК; 3. рост нити пре-РНК; 4. освобождение в сайте терминации пре-РНК и РНКполимеразы из комплекса с ДНК ускоряют факторы терминации. www. themegallery. com
Стадия элонгации • Факторы элонгации (E, H, F) повышают активность РНК-полимеразы и облегчают локальное расхождение нуклеотидных цепей. Синтез молекулы РНК идет от 5 - к 3 -концу на матричной цепи ДНК по принципу комплементарности и антипараллельности. По мере продвижения РНК-полимеразы по цепи ДНК в направлении от 3'- к 5'-концу впереди нее происходит расхождение, а позади - восстановление двойной спирали. www. themegallery. com
Стадия терминации • Расхождение двойной спирали ДНК в области сайта терминации делает его доступным для факторов терминации. Когда РНК-полимераза достигает сайта терминации, транскрипция прекращается. Факторы терминации облегчают отделение первичного транскрипта от матрицы. www. themegallery. com
4. Обмен нуклеотидов (состав, биосинтез, катаболизм). Нарушение обмена азотистых оснований (подагра). L/O/G/O
5. Биосинтез белков. Аминокислотный код. Этапы трансляции (подготовительный, элонгация, пострибосомная трансформация полипептидной цепи). Ингибиторы L/O/G/O трансляции.
Трансляция • Трансляция (от лат. translatio — перевод) - процесс синтеза белка из аминокислот на матрице информационной (матричной) РНК (и. РНК, м. РНК), осуществляемый рибосомой.
Процесс трансляции разделяют на 1. инициацию — узнавание рибосомой стартового кодона и начало синтеза. 2. элонгацию — собственно синтез белка. 3. терминацию — узнавание терминирующего кодона (стопкодона) и отделение продукта.
Стадия инициации белкового синтеза • • Комплекс, состоящий из 40 S-субъединицы рибосомы, Мет-т. РНКМет, факторов инициации и молекулы ГТФ, присоединяется к м. РНК и перемещается по ней до встречи с инициирующим кодоном AUG. Антикодон Метт. РНКМет связывается с кодоном AUG, это сопровождается присоединением к комплексу 608 субъединицы рибосомы, гидролизом ГТФ и удалением факторов инициации. На рибосоме формируются А- и Р-центры. Метт. РНКМет оказывается в Р-центре рибосомы. В процессе инициации участвует более 10 факторов инициации Инициация начинается с присоединения к м. РНК в области «кэпа» малой субъединицы рибосомы 40 S, факторов инициации (IF), инициирующей Метт. РНКМет и ГТФ. Когда в результате движения этого комплекса по м. РНК антикодон Метт. РНКМет свяжется с инициирующим кодоном АUG, комплекс останавливается. Происходит присоединение 60 S-субъединицы рибосомы, сопровождающееся гидролизом ГТФ и отделением факторов инициации. Формируется 80 S-рибосома с двумя активными центрами: Р(пептидильным) центром, в котором находится Мет-т. РНКМет, А(аминоацильным) центром, в область которого поступает первый смысловой кодон м. РНК.
Этап элонгации включает три последовательные стадии • Связывание аа-т. РНКаа в А-центре. В свободный А-центр присоединяется первая аа 1 -т. РНКаа 1 (на рисунке это Валт. РНКВал), у которой антикодон комплементарен кодону м. РНК, находящемуся в области этого центра. Эта фаза процесса требует затраты энергии ГТФ и участия фактора элонгации EF 1. 1. связывание аа-т. РНКаа в А-центре требует затраты энергии ГТФ и участия фактора элонгации EF 1 (на схеме аа-т. РНКаа - Вал-т. РНКВал); 2. образование пептидной связи катализирует пептидилтрансфераза, активный центр которой формируется р. РНК, входящей в состав большой субъединицы рибосомы; 3. перемещение рибосомы по м. РНК на один кодон в направлении от 5'- к 3'концу идет с использованием энергии ГТФ (транслокация) и при участии фактора EF 2
Этап элонгации (продолжение) • При попадании в А-центр стоп-кодона вновь синтезированный пептид высвобождается из связи с т. РНК и рибосомой с участием факторов терминации и энергии ГТФ • Образование пептидной Пептидил-т. РНК связи. На этой стадии происходит пептидилтрансферазная реакция, в ходе которой метионин от Мет-т. РНКМет, входящей в Р-центр, переносится на α-аминогруппу аминокислоты (валина), находящейся в А-центре в составе аат. РНКаа, с образованием дипептидилт. РНК. В пептидилтрансферазной реакции ферментативную активность проявляет р. РНК большой субъединицы рибосомы.
Транслокация • Транслокация - перемещение рибосомы по м. РНК. В ходе этой стадии рибосома сдвигается на один кодон в направлении от 5'- к 3'-концу м. РНК за счет энергии ГТФ и при участии фактора элонгации EF 2. В результате дипептидил-т. РНК (Мет-Валт. РНК) из А-центра попадает в Р-центр, а в Ацентре оказывается следующий кодон. Свободная т. РНКМет теряет связь с Р-центром и покидает рибосому. Далее процесс продолжается по описанной схеме, повторяя стадии: Η 2 -> 3.
Терминация синтеза белка • Терминация трансляции происходит после включения в А-центр одного из стоп кодонов: UAG, UGA, UAA. Белковые факторы терминации RF 1 и RF 3, взаимодействуя с этими кодонами, при участии пептидилтрансферазы обеспечивают гидролитическое отщепление синтезированного полипептида от т. РНК, а также освобождение т. РНК из пептидильного центра и диссоциацию рибосомы на субъединицы с затратой энергии молекулы ГТФ. Название факторов происходит от англ. releasing factor - RF, а цифры указывают на их сходство по строению с RF-факторами 1 -го и 3 -го прокариотов. www. themegallery. com
Полисома • Одновременно несколько рибосом могут участвовать в трансляции одной м. РНК. Каждая рибосома занимает участок, равный примерно 80 нуклеотидам м. РНК. Таким образом, рибосомы располагаются на м. РНК с интервалами около 100 нуклеотидов, образуя комплекс, называемый полисомой.
Функционально активные белки образуются в результате посттрансляционных модификаций полипептидных цепей, синтезированных на рибосомах. Они включают: 1. частичный протеолиз; 2. фолдинг, или формирование пространственной структуры, в котором принимают участие белки-шапероны, обеспечивающие образование функционально активной конформации полипептидной цепи; 3. модификации аминокислот: карбоксилирование, фосфорилирование, йодирование, гидроксилирование, ацилирование и гликозилирование; 4. образование дисульфидных связей между остатками цистеина, участвующими в формировании трехмерной структуры белка; 5. присоединение простетических групп; 6. образование олигомерных структур, которое также осуществляется при участии шаперонов.
Ингибиторы трансляции www. themegallery. com
Ингибиторы транскрипции 1) Рифамицин - ингибирует РНКполимеразу (в ядре). 2) Актиномицин D – связывается с ДНК матрицей и препятствует продвижению РНК-полимеразы. 3) Олигомицин 4) Дактиномицин www. themegallery. com
Ингибиторы трансляции 1) Тетрациклины – блокируют связывание аминоацил-т. РНК к А-центру, связываются с 30 S субъединицей (ингибируют элонгацию). 2) Стрептомицин связывается с 30 S субъединицей и (ингибирует инициацию). 3) Эритромицин присоединяется к 50 S субъединице и (ингибирует транслокацию). 4) Хлорамфеникол (левомицетин) – ингибирует пептидил трансферазу (транспептидацию). 5) Пуромицин – похож на аминоацил-т. РНК, вызывает преждевременную терминацию. 6) Линкомицин – как хлорамфеникол. www. themegallery. com
www. themegallery. com
Скачать презентацию Лекция 12 Биохимия нуклеиновых кислот Матричные биосинтезы
Lektsia_12_Biokhimia_nukleinovykh_kislot_matri.ppt