Лекция 1 Световая микроскопия Разновидности световой микроскопии, их

Лекция 1 Световая микроскопия Разновидности световой микроскопии, их применение

Макрообъекты Клеточная форма жизни

Первые очки были изобретены в Италии в 1285 г. Сальвинио дели Арлеати 1590 г. Захарий и Ханс Янсены две выпуклые линзы внутри одной трубки фактически создали первый микроскоп увеличение составляло от 3 до 10 раз

Antoni van Leeuwenhoeck (1632 -1723) 1680 г. – открытие мира микроорганизмов Современные снимки микроорганизмов, сделанные с помощью «Микроскопа Левенгука»

Микроскоп Гука 1665 г. – открытие клетки Роберт Гук Принципиальная схема микроскопа и осветительной системы

XVIII век Микроскоп Лизелотты Фон дер Пальц (Версаль) 1857 г. “Stativ 1” Карл Цейсс Слева - микроскоп фирмы «Уцшнейдер унд Фраунгофер» , около 1820 г. Справа - микроскоп Джованни Батиста Амичи, около 1845 г. Йенский оптический музей Микроскоп Эрнста Лейца 1950 -е

Классический микроскоп Увеличение объекта происходит двумя шагами: 1. Объектив формирует увеличенное перевернутое изображение объекта в т. н. промежуточной плоскости (действительное промежуточное изображение) 2. Окуляр увеличивает промежуточное изображение, и глаз наблюдает увеличенное мнимое окончательное изображение препарата Общее увеличение: Увеличение объектива Х на увеличение окуляра

Микроскопы Leica Axiolab (Цейсс)

РАЗРЕШЕНИЕ микроскопа определяет качество изображения Разрешающая способность микроскопа – предел, до которого два маленьких объекта воспринимаются раздельно Формула разрешающей способности объектива: _λ__ R= 2 NA R - предел разрешения; Λ - длина волны; NA - числовая апертура. Или: R = 0, 61 (λ / nsinα) λ –длина волны света n - коэффициент преломления среды α - угол между оптической осью объектива и наиболее отклоняющимся лучом, попадающим в объектив

Для видимого света (длина волны 400 -700 нм) максимальное разрешение не может быть выше 200 -350 нм (0, 2 -0, 35 мкм). Для ультрафиолетового света – 130 -140 нм Невооруженный глаз различает 0, 08 – 0, 2 мм, световой микроскоп увеличивает разрешающую способность глаза в 1000 раз Контраст более 3 -5% - условие «видимости» Объектив – «главная» деталь микроскопа

Иммерсионный и «сухой» объективы Вид иммерсионной жидкости Цветовая маркировка на объективе

Современные микроскопы Оптика ISC (Infinity Color-corrected System) Объектив проецирует изображение на «бесконечность» Тубусная линза формирует промежуточное изображение Лучи между объективом и тубусной линзой идут параллельно Больший угол зрения ( «Бесконечная оптика» )

При работе с микроскопом ВАЖНО - Использовать покровные стекла не толще 0, 17 мм - Правильно устанавливать освещение (установка света по Кёллеру) - Тщательно контролировать перемещение объектива при фокусировке «сильных» (40 х, 60 х, 90 х, 100 х) объективов - Соблюдать чистоту и осторожность, не трогать пальцами стеклянные детали

Световая микроскопия В проходящем свете В отраженном свете Микроскопия в светлом поле Микроскопия (микроскопия окрашенных непрозрачных препаратов) препаратов гистохимия иммуногистохимия авторадиография - Микроскопия в темном поле - Поляризационная микроскопия - Фазово-контрастная микроскопия - Интерференционная микроскопия - Микроскопия в ультрафиолетовом свете

Микроскопия в светлом поле (микроскопия окрашенных препаратов)

Снимок ворсин толстого кишечника курицы, объектив 40 Парафиновый срез, окраска гематоксилином и эозином

Микроскопия в темном поле Лептоспира Диатомит Без объекта – поле темное, освещение – полый конус, не попадающий в объектив Кольцевая диафр-ма в конденсоре Макротрикс Объект отклоняет свет, он попадает в объектив – объект становится видимым на темном фоне

Borrelia miyamotoi Спирохета Obelia Гидроидный полип с «золотыми» диатомовыми водорослями «Ножка» рачка Phronima sp. Мышцы и ряды пигментных клеток.

Сферические колонии сине-зеленых водорослей вида носток обыкновенный (Nostoc commune), изображение получено методом темного поля. Микрофото Герда Гюнтера из Дюссельдорфа. Голова, антенны и хоботок самца комара

Фазово-контрастная микроскопия в проходящем свете 1934 г. – метод описан Ф. Цернике 1953 г. – Нобелевская премия по физике Идеальный метод для наблюдения тонких неокрашенных образцов, имеющих различия в толщине (клетки на стекле) Имеются различия в показателе преломления: между клеткой и окружающей водной средой; между ядром и цитоплазмой Революция в медико-биологических исследованиях

Смещение фазы преобразуется в различия интенсивности света, объект становится видимым Специальная оптика

Фазово-контрастная микроскопия в проходящем свете Bacillus Cereus на лотной питательной среде Макрофаг Фибробласты Кардиомиоциты Нейроны Chromatiumokenii Включения серы

Инфузория парамеция. Сократительная вакуоль. Изображение получено методом фазового контраста. Эдвин Ли из Карролтона, штат Техас, четвертое место на конкурсе «Olympus Bio. Scapes» 2011 г. (Edwin Lee)

Клетки эпителия (мазок) Фибробласт в культуре Микроскопия в светлом поле Фазово-контрастная микроскопия Интерференционная микроскопия Микроскопия в темном поле

Инвертированные микроскопы Axiovert 40 C (Цейсс)

Культуры клеток, монослой MDCK Vero MDCK

Интерференционная микроскопия Нематода, оптика Nomarski Хромосомы Интерференционная микроскопия Деление клетки Спириллы Интерференционная Микроскопия

Поляризационный контраст в проходящем свете Анализатор не пропускает лучи, проходящие через поляризатор без препарата: темное поле Образец поворачивает плоскость света, приходящего через поляризатор Анализатор Изображение Двулучепреломляющие материалы (крахмал, полимеры, кристаллы) Поляризатор

Различные волокна Поляризационная микроскопия Хлопок Шерсть Нейлон Шелк-сырец

Сперматозоид комара-долгоножки (Nephrotoma suturalis) в процессе клеточного деления. Микроскопия в поляризованном свете. Изображения получены Джеймсом Лафонтеном из SUNY-Buffalo и Рудольфом Олденбургом из лаборатории Woods Hole Marine Biological Laboratory, восьмое место на конкурсе «Olympic Bio. Scapes» .

Дифференциально-интерференционный контраст в проходящем свете 1. Луч плоскополяризованного света расщепляется призмой Волластона на два луча. Они проходят через объект очень близко друг к другу, однако достаточно далеко для глаза наблюдателя, что создает эффект объемности за счет различий интенсивности освещенности деталей в конечном изображении. 2. Два луча совмещаются второй призмой Волластона, расположенной в задней фокальной плоскости объектива. 3. Анализатор завершает формирование изображения. Два луча имеют боковой сдвиг друг относительно друга, и направление сдвига воспринимается как направление подсветки изображения с одной стороны.

Диатомея ДИК Нематода Фаз. контраст «Давленый» препарат клеток. Митоз Коловратка Хромосомы. Митоз

Коловратка (Floscularia ringens), крошечный подводный организм с волосовидными ресничками, которые вращаются с высокой скоростью, заталкивая пищу в рот. На снимке виден коричневатый трубчатый дом коловратки, один из «кирпичей» которого находится в процессе образования внутри тела коловратки. Метод дифференциального интерференционного контраста. Чарльз Кребс из Айсаквы, штат Вашингтон, (Charles Krebs / Charles Krebs), 1 место на конкурсе «Olympic Bio. Scapes» .

Микроскопия в ультрафиолетовом свете Люминесцентная (флуоресцентная) микроскопия -Собственная люминесценция (редкое явление) - Флуорохромирование - окрашивание сильно разведенными растворами флуоресцирующих красителей (флуорохромов) - Иммунофлуресценция (непрямая флуоресценция) Наиболее распространенный метод Цвет люминесценции смещен в более длинноволновую часть спектра по сравнению с возбуждающим ее светом (правило Стокса).

Микроскопия в ультрафиолетовом свете Люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия Риккетсии, окрашенные флюорохромом Митохондрии, окрашенные родамином Микротрубочки, окрашенные АТ к тубулину. Ядро окрашено флуоресцентным красителем к ДНК.

Иммунофлуоресцентная микроскопия (флуоресцирующая метка связана со специфическими антителами).

Конфокальная лазерная микроскопия позволяет визуализировать флуоресцирующие молекулы в одной плоскости Клетки культуры CV-1, зараженные вирусом оспы коров. Ядро, вирусные антигены, актин Итактная клетка Ядро, актиновый цитоскелет

Структуры цитоскелета (конфокальная микроскопия)

Ворсины кишечника Нейроны

Мышечные и нервные структуры репродуктивной системы дрозофилы, в том числе матка и яичники. Метод флуоресцентной микроскопии. Гуннар Ньюквист из Университета Невады, 7 место на конкурсе «Olympus Bio. Scapes» (Gunnar Newquist / University of Nevada).

GFP – green fluorescent protein (зеленый флуоресцирующий белок) Медуза Aequorea victoria Фотоорган, содержащий GFP был выделен в 1962 г. Osamu Shimomura с сотр. В 1992 г. GFP был впервые клонирован, а вскоре было показано, что ген GFP, встроенный в другие организмы, экспрессируется и дает флуоресцирующий белок. Клонирование GFP в E. coli В 2008 г. Osamu Shimomura, Marty Chalfie, и Roger Tsien получили Нобелевскую премию по химии «за открытие и применение GFP» .

Экспрессия GFP в структурах почки Нейрон, визуализированный с помощью GFP

Лист дерева, рельеф Личинка комара Клетки в состоянии мейоза Neurospora crassa Морской шприц

Дополнительные возможности микроскопии - Разнообразные измерения, в зависимости от типа микроскопа - Компьютерная обработка данных измерений - Современные программы обработки изображений - Фотосъемка Бляшка – повреждение монослоя клеток Неровные контуры Для оценки изменений площади бляшек использовали измерение оптической плотности

Микроскоп надо любить! - чистота – залог здоровья!! - защита от пыли - не прикладывать чрезмерных физических усилий - строго соблюдать инструкцию - не ремонтировать самостоятельно!!!