Лекция 1 Ферменты генной инженерии Современная

Лекция № 1 Ферменты генной инженерии

Современная стратегия генной инженерии Ø В небольшую молекулу ДНК, способную реплицироваться в клетке автономно от хромосомы (плазмида или вирусная ДНК), ферментативно встраивают фрагменты молекул ДНК любого изучаемого организма или искусственно синтезированные фрагменты ДНК. Ø При этом образуются молекулы (гибридные ДНК), которые вводят в прокариотические или эукариотические клетки, где они реплицируются. Таким образом, в их составе происходит размножение встроенных фрагментов ДНК. Ø Определенными методами отбирают клоны клеток или вирусов, содержащие индивидуальные типы молекул гибридных ДНК. Ø Выявленные гибридные ДНК подвергают разностороннему структурно -функциональному изучению. Особую роль при этом играют методы расшифровки последовательности нуклеотидов (секвенирования) фрагментов ДНК.

Рекомбинантными ДНК (рек. ДНК) называют молекулы ДНК, создаваемые методами генетической инженерии. Гибридные ДНК – это молекулы ДНК, конструированные in vitro. Детерминируемые гибридными генами «составные» белки, состоящие из ковалентно связанных аминокислотных последовательностей разных белков называют химерными.

Ферменты, наиболее часто используемые в генно-инженерных работах. Рестриктазы Ø ДНК-лигазы Ø ДНК-полимеразы Ø Обратная транскриптаза Ø Концевая дезоксинуклеотидилтрансфераза Ø Поли (А)-полимераза E. coli Ø

Рестрикция, контролируемая хозяином - «host controlled restriction» Escherichia coli К 12 - Фаг λ·К Escherichia coli С - Фаг λ·С 1953 г. Г. Бертани, Дж. Уэйгл. Рестриктаза = эндонуклеаза рестрикции = = сайтспецифическая эндодезоксирибонуклеаза

Номенклатура рестриктаз предложили в 1973 г. Х. Смит и Д. Натанс 1. Название каждого фермента является производным от бинарного родо-видового обозначения микроорганизма-хозяина, содержащего данную R-M систему. К первой прописной букве названия рода добавляют две первые строчные буквы вида. Пример: Escherichia coli – Eco, Streptomyces albus – Sal. 2. За родо-видовым названием следует, в случае необходимости, обозначение серотипа или штамма: например, Haemophilus influenzae d – Hind, Escherichia coli B – Eco. B. 3. Различные системы рестрикции-модификации, кодируемые одной бактериальной клеткой, обозначаются римскими цифрами, например, Hind II, Hind III. 4. Ферменты рестрикции-модификации в общем виде обозначаются как эндонуклеаза R или метилаза М, с последующим определением названия системы, например: эндонуклеаза R Hind II или метилаза M Hind II. 5. Если система генетически локализована на плазмиде, то после родового названия указывается символ внехромосомного элемента, например, Eco. РI. Штаммовая принадлежность указывается в скобках Eco(К)РI.

Дополнения В 1978 г. Р. Робертс внес некоторые дополнения в вышеописанную систему обозначений ферментов. В случае, когда название совпадает для нескольких ферментов, оставляют неизменными первые две буквы, а третью берут из последующих букв видового названия. Пример: Haemophilus parainfluenzae – Hpa. I, Haemophilus parahaemolyticus – Hph. I. Д. Шибата с соавторами предложили после латинской родо-видовой символики вводить музейный номер бактериальной культуры, например, Pvu 84 II, Hinb 1076 III.

Рестриктазы I типа Примеры: Есо. В, Есо К, Sty. SKI, Spt. SQI и другие. R M He l M M R Сложная молекула с тремя различными типами субъединиц (эндонуклеаза, метилаза, фермент узнавания). Молекулярная масса 400 – 600 к. Да. Кофакторы: АТФ, SAM и ионы Mg 2+. Узнаваемая последовательность - непалиндромная структура. Пример: сайт узнавания для Есо. В 5 - AAC(N)6 Pu. TAPy. G - 3 3 - TTG(N)6 Py. ATPu. C - 5

Рестриктазы II типа (II и IIS) Примеры: Eco. RI, Hha. I, Pvu. II, Bam. HI, Sma. I, Hind II и другие. М М R R Эндонуклеаза и метилаза – разные молекулы, димеры одинаковых субъединиц. Молекулярная масса 50 – 100 к. Да. Кофакторы: ионы Mg 2+. Узнаваемая последовательность палиндромная структура. Пример: сайт узнавания для Bam. HI 5 - GGATCC - 3 3 - CCTAGG - 5 Подкласс II S – непалиндромная структура сайт узнавания для Hga. I 5 - GACGC - 3 3 - CTGCG - 5

Рестриктазы II типа Alu. I (расщепляет ДНК с образованием тупых концов): ↓ 5…. N-N-A-G-C-T-N-N-……. . 3 5…. N-N-A-G 3 5…. C-T-N-N…. 3 3…. N-N-T-C-G-A-N-N-……. 5 3…. N-N-T-C 5 3…. G-A-N-N…. 5 ↑ Eco. RI (образуются взаимокомплементарные липкие 5 - концы): ↓ 5…. N-N-G-A-A-T-T-C-N-N…. 3 5…. N-N-G 3 5 A-A-T-T-C-N-N…. 3 3…. N-N-C-T-T-A-A-G-N-N…. 5 3…. N-N-C-T-T-A-A 5 3 G-N-N…. 5 ↑ Pst. I (образуются липкие 3 - концы): ↓ 5…. N-N-C-T-G-C-A-G-N-N…. 3 5…. N-N-C-T-G-C-A 3 5 G-N-N…. 3 3…. N-N-G-A-C-G-T-C-N-N…. 5 3…. N-N-G 5 3 A-C-G-T-C-N-N…. 5 ↑

Рестриктазы III типа Примеры: Eco. PI, Eco. P 15 I, Sty. LTI, Hine. I и другие. М М Hel R Сложная молекула с двумя субъединицами (эндонуклеаза, метилаза). Молекулярная масса 200 – 300 к. Да. Кофакторы: АТФ, ионы Mg 2+, SAM стимулирует активность. Узнаваемая последовательность непалиндромная структура. Пример: сайт узнавания для Hine. I 5 - CGAAT - 3 3 - GCTTA - 5

Изошизомеры – это рестриктазы из разных видов бактерий, узнающие одни и те же сайты рестрикции. Гетерошизомеры – это ферменты, которые узнают одни и те же последовательности, но расщепляют их по разному.

Механизм лигирования ДНК Т 4 -ДНК-лигазой 1. Е + АТФ ↔ Е – АМФ + РР Е - АМФ OH O O │ O- ─P═O │ O- ¨ АМФ O │ O- ─P═O │ O O│ O- ─P═O │ Аденозин O ║ O- ─ P─ O │ O-

ДНК-лигазы 2 семейства 1. АТР – зависимые лигазы (у бактериальных и эукариотических вирусов, дрожжей, млекопитающих и эубактерий) 2. NAD – зависимые лигазы (обнаруживаются у эубактерий)

ДНК- полимераза E. coli 1958 г. А. Корнберг и соавторы. Мономер, молекулярная масса 103 к. Да. Имеет трехдоменную структуру. Каждый домен белка обладает отдельной ферментативной активностью: N-концевой домен – 5 -3 –экзонуклеазной; Ø С-концевой домен - 5 -3 – полимеразной; Ø средний домен – 3 -5 -экзонуклеазной. Ø

Обратная транскриптаза 1970 г. Х. Темин и С. Мизутани, Д. Балтимор. Вирус саркомы Рауса. ревертаза = обратная транскриптаза Обратная транскриптаза обладает следующими ферментативными активностями: Ø ДНК-полимеразная ( ОТ использует в качестве матрицы как РНК, так и ДНК); Ø Активность РНКазы Н ( ОТ гидролизует РНК в составе гибрида ДНК-РНК, но не одно- или двухцепочечную РНК); Ø ДНК-нуклеазная активность.

Концевая дезоксинуклеотидилтрансфераза 1962 г. Ф. Боллум, тимус теленка. Фермент катализирует последовательное присоединение дезоксинуклеотидов к 3 - ОН концу молекулы ДНК. дезоксинуклеотидилтрансфераза = терминальная трансфераза

Поли(А)-полимераза E. coli 5 РНК Открыт в 1973 году, А. Сиппелом. ОН 3 АТР; Mg; Mn; Катализирует присоединение к свободному 3 – ОН концу одноцепочечных молекул РНК поли (А)-последовательностей. 5 Ар(Ар)n. А-ОН 3

Ферменты нуклеинового обмена, используемые в экспериментах по клонированию фрагментов ДНК Полинуклеотидкиназа; Ø Щелочная фосфатаза; Ø 5 -эндонуклеаза фага λ; Ø Экзонуклеаза III E. coli; Ø Рибонуклеазы; Ø Метилазы; Ø