Лекции по молекулярной биофизике Юрий Андреевич Владимиров yuvlad mail

Эволюция молекулярной биологии Физика 5 1 Молекулярная биология Структурная биология 2 Генетика Геномика Структурная 4 геномика Структурная протеомика © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ) 6 Протеомика 3 6

Молекулярная биофизика Физика белка Физика НК Структура белка © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ

Двойная спираль И рентгеновская дифрактограмма вытянутых нитей ДНК 1953 Джеймс Уотсон, Френсис. Крик ©

Рождение молекулярной биологии Розалинд Френклин Franklin, R. E. and R. G. Gosling (1953). "Molecular configuration in sodium thymonucleate. " Nature 171(4356): 740 -1. Джеймс Уотсон Watson, J. D. and F. H. Crick (1953). "Molecular structure of nucleic acids; a structure for deoxyribose nucleic acid. " Nature 171(4356): 737 -8. Френсис Крик © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ)

Протеом (Proteome) From Wikipedia, the free encyclopedia The proteome is the entire complement of proteins expressed by a genome, cell, tissue or organism. More specifically, it is the expressed proteins at a given time point under defined conditions. The term is a blend of proteins and genome. It was coined by Marc Wilkins first in 1994 in the symposium: "2 D Electrophoresis: from protein maps to genomes" in Siena, Italy. Proteomics is the large-scale study of proteins, particularly their structures and functions. Mesh database NLM The systematic study of the complete complement of proteins (PROTEOME) of organisms. © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ)

Когда возникла протеомика? Основные вехи в развитии протеомного анализа: 1970 г. Х. Стегеманн. Впервые описал технику комбинации изоэлектрического фокусирования и электрофореза в ПААГ; 1977 г. О′ Фарелл с соавт. Предложил 2 D-электрофорез с разделением белков в первом направлении с помощью неравновесного градиента р. Н, сформированного с помощью амфолинов; 1982 г. Б. Бьёллквист с соавт. Введение в практику двумерного разделения белков с помощью иммобилизованного на ПААГ градиента р. Н (IPG). IPG-стрипы. ; 1982 г. Группа авторов во главе с Джоном Феном. Изобретение электроспрейной ионизации (ESI); 1987 г. Коити Танака. Изобретение матриксной лазерно-десорбционной ионизации (MALDI). 1982 г. Лэй Андерсон. Предложил создать белковый атлас человека с использованием 2 Д-электрофореза. 1995 г. Ян Хемпрли-Смит. Предложил использовать термин протеом, подразумевая инвентаризацию всех белков клетки. © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ)

Одномерный гель-электрофорез © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ)

Expressional Proteomics Prostate tumor Lecture 1. 0 © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ)

Expressional Proteomics 2 -D Gel Lecture 1. 0 © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ

Первичная структура белков Секвенирование © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ)

Первичная структура Вцепи инсулина 1951 Frederic Sanger PHE VAL ASN GLN HIS LEU CYS GLY SER HIS LEU VAL GLU ALA LEU TYR LEU VAL CYS GLY GLU ARG GLY PHE TYR THR PRO LYS Sanger, F. and H. Tuppy* (1951). "The amino-acid sequence in the phenylalanyl chain of insulin. 1. The identification of lower peptides from partial hydrolysates. " Biochem. J. 49: 463 -481. © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ)

Первый случай установления первичной структуры: Фредерик Сэнгер и инсулин • 1. Сначала С. разделил две цепи инсулина А и B, • 2. Провел их специфическое ферментативное расщепление на небольшие пептиды с перекрывающимися участками последовательностей. • 3. Разделил пептиды • 4. Используя реагент 1 -фтор-2, 4 -динитробензол идентифицировал N-концы аминокислот (см. следующий слайд) • 5. Сравнивал последовательности перекрывающихся пептидов и установил аминокислотную последовательность целой цепи. © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ)

Разделение на фракции В-цепи © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ)

Определение первичной структуры полипептидной цепи инсулина (F. Sanger, H. Tuppy, 1951). Гидролизат фракции B Кислые пептиды Электрофоре з, p. H 2, 6 Cysпептиды Электрофоре з, p. H 3, 3 Адсорбированные пептиды Asp-, Gluпептиды (Sanger, F. and H. Tuppy* (1951). "The amino-acid sequence in the phenylalanyl chain of insulin. 1. The identification of lower peptides from partial hydrolysates. " Biochem. J. 49: 463 -481. ) © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ) Нейтральные и основные пептиды Адсорбция Электрофоре з Нейтральные Основные пептиды

Препаративное разделение пептидов 8 Разделение пептидов методом двумерной хроматографии на бумаге Элюция пептидов для дальнейшего секвенирования (Sanger, F. and H. Tuppy* (1951). "The amino-acid sequence in the phenylalanyl chain of insulin. 1. The identification of lower peptides from partial hydrolysates. " Biochem. J. 49: 463 -481. ) © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ)

Рис. 00 1 -фтор-2, 4 -динитробензол (FDNB) FDNB- производное аминокислоты © 2012 Ю. А.

Gly COOH H 2 N Cys H 2 N Gly Cys COOH H 2

Секвенирование тетрапептида Без После обработки FDNP Цепочка по данным опыта Окончательная цепочка FDNP Pro, Thr Pro Thr-Pro Ala, Lys Ala Lys-Ala Ala, Lys, Pro Lys, Ala Pro-(Lys, Ala) Pro-Lys-Ala Ala, Lys, Pro, Ala, Lys, Thr-( Ala, Lys, Thr-Ala-Lys-Pro Thr Pro © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ) Pro)

Схема последовательного отщепления «меченных» остатков Pehr Victor Edman (April 14, 1914 — March 19, 1977) was a Swedish biochemist. He developed a method for sequencing proteins, the Edman degradation © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ)

Секвенсер Эдмана © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ)

Рождение структурной биологии – 1957 год. Нобелевская премия 1962 год Max Ferdinand Perutz John Cowdery Kendrew The production of a threedimensional model of myoglobin at 6Å resolution in 1957, and an almost complete structure in 1960. Миоглобин Гемоглобин © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ)

Субъединица каталазы © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ)

Структурная биология Рентгеновская кристаллография Цитохром с ЯМР высокого разрешения Компьютерное моделирование Зондовая микроскопия Электронная микроскопия Малоугловое рассеяние Динамическое рассеяние света ИК-спектроскопия Изучение люминесценции © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ)

Методы структурной биологии *Hartmut Oschkinat, FESP Workshop, Skåvsjöholm, 13 -15 Nov 2006 © 2012

Вопросы к зачету 1. Дать определения первичной, вторичной, третичной и четвертичной структуры белка. 2. Что такое геномика и протеомика? 3. То Вам известно о первых работах по молекулярной биологии? 4. Перечислите основные методы исследования, применяемые в структурной молекулярной биологии. 5. Что Вы знаете о методе гель-электрофореза? 6. Что Вы знаете о методе белковой кристаллографии © 2012 Ю. А. Владимиров (ФФМ МГУ)