Лабораторное занятие № 6 по дисциплине: «Лабораторная диагностика» Тема занятия: «Гематологические исследования» Саратов, 2017
План: 1. Состав крови 2. Взятие и подготовка проб крови 3. Подсчет форменных элементов крови 4. Приготовление, окрашивания и исследования мазков крови
1. Состав крови Кровь состоит из жидкой части – плазмы и находящихся в ней во взвешенном состоянии форменных элементов – эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов. Для получения плазмы кровь необходимо предохранить от свертывания добавлением антикоагулянтов. Такая кровь после длительного стояния в пробирке или центрифугирования разделяется на плазму (верхний слой) и форменные элементы. Если выпущенную в сосуд кровь не стабилизировать антикоагулянтом, происходит ее свертывание – образование сгустка, содержащего форменные элементы и выпавший в осадок белок фибриноген.
1. Состав крови Сгусток постепенно уплотняется, стягивается и от него отделяется прозрачная желтоватого цвета жидкость – сыворотка. Сыворотка представляет собой плазму, лишенную фибрина. Если выделить из крови фибриноген механическим путем, то такая кровь теряет способность к свертыванию. Она содержит все составные части, за исключением фибриногена, и называется дефибринированной кровью.
1. Состав крови
1. Состав крови
2. Взятие и подготовка проб крови Небольшое количество крови для общего анализа берут из сосудов внутренней или наружной поверхности ушной раковины. У собак, кошек, пушных зверей кровь берут из латеральной подкожной вены предплечья или голени, лапки (пальца), кончика хвоста; у кур — из гребня или сережки, вен внутренней поверхности крыла; у уток и гусей — из ступни конечности или большой плюсневой вены. Когда для анализа необходимо большое количество цельной крови, сыворотки или плазмы, кровь у крупного рогатого скота, лошадей, овец, коз, верблюдов берут из яремной вены, у свиней — из орбитального венозного синуса, у плотоядных — из вен конечностей, у птиц — из вен внутренней поверхности крыла.
2. Взятие и подготовка проб крови У моногастричных животных кровь берут до кормления в утренние часы, у жвачных животных — утром через 4 ч после кормления. Время кормления существенно влияет на содержание в крови липидов, сахара, холестерина и некоторых других показателей. Чрезмерное возбуждение животного во время взятия крови (стресс) влияет на показатели кислотно-щелочного равновесия, сахара, многих гормонов, количество эозинофилов и лимфоцитов. Во многом биохимические показатели крови зависят от фармакологических препаратов, токсических веществ, испорченных кормов. Все эти факторы должны быть учтены при отборе проб крови.
2. Взятие и подготовка проб крови В зависимости от характера исследований готовят одну или две пробирки. Для общего анализа крови (ОАК) используют пробирки с противосвертывающимися средства (антикоагулянты). Для биохимического анализа крови (БАК) готовят пробирки с активатором образования сгустка. Кровь в пробирки набирают по стенке во избежание гемолиза. В лабораторию ее доставляют в день взятия в термосе. При отправке в лабораторию не допускают замораживания или сильного охлаждения крови, так как это приводит к гемолизу.
3. Подсчет форменных элементов крови К форменным элементам крови относятся эритроциты, лейкоциты и тромбоциты. В единице объема крови форменные элементы находятся в количестве, относительно постоянном для данного вид, животных. Однако их содержание колеблется в зависимости от возраста, пола, физиологического состояния животных, условий окружающей среды. В ветеринарной практике подсчет форменных элементов имеет большое диагностическое значение. Подсчет эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов производят в определенном объеме крови (1 мм 3) при помощи специальных счетных камер, с предварительным разбавлением крови. Разработаны также автоматические методы подсчета с помощью фотометрических и электронных приборов. Форменные элементы подсчитывают в цельной или стабилизированной крови животных.
3. Подсчет форменных элементов крови Эритроциты – безъядерные, округлые элементы крови, содержащие гемоглобин. Основная функция эритроцитов – перенос кислорода от органов дыхания к клеткам организма. Эритроциты млекопитающих имеют форму двояковогнутого диска, не содержат ядра; их диаметр 5 мк, толщина 2 -2, 5 мк: У рыб, амфибий и птиц эритроциты имеют овальную форму, более крупные размеры (11 -13 мкм) и содержат ядро. Ход определения. В сухую чистую пробирку вносят 8 мл 0, 9%ного раствора натрия хлорида и капиллярной пипеткой 0, 02 мл крови. Предварительно кончик пипетки вытирают, кровь выдувают на дно пробирки, а пипетку тщательно промывают верхним слоем жидкости. Содержимое пробирки хорошо перемешивают. Получают разведение крови 1 : 400, т. е. кровь разбавляют в 400 раз. При сгущении крови ее целесообразно разбавить в 500, 600, 700, 800 раз.
3. Подсчет форменных элементов крови Камера и покровное стекло должно быть вымыты и насухо вытерты. Покровное стекло притирают к камере так, чтобы появились радужные кольца. Берут каплю разведенной крови из пробирки и заполняют ею камеру, нанося к краю покровного стекла. Эритроциты подсчитывают через 1 мин после заполнения камеры под малым увеличением микроскопа в пяти больших (или 80 малых) квадратах, расположенных по диагонали. Учитывают эритроциты, лежащие внутри малого квадрата, а также на левой и верхней его стенках. Клетки, находящиеся на правой и нижней линиях квадрата, не считают. Расчет. Подсчитанное число клеток в 80 малых квадратах умножают на 20 000 при разведении крови 1 : 400, на 25 000 при разведении 1 : 500 или на 30 000 при разведении 1 : 600 и получают окончательный результат в миллионах в 1 мкл. При этом исходят из того, что объем одного малого квадрата равен 1/4000 мкл. Для подсчета клеток в 1 л количество эритроцитов в 1 мкл еще умножают на 1 000 (Ю 12/л).
3. Подсчет форменных элементов крови Лейкоциты играют важную роль в защитных процессах в организме. Они выполняют функции фагоцитоза, образования антител, обезвреживания и удаления токсинов. Лейкоциты – более крупные клетки, чем эритроциты (их диаметр 10 -26 мкм); они имеют неодинаковую форму ядер и неоднородную протоплазму. Ход определения. От каждого животного целесообразно готовить 2— 3 образца разведенной крови. В пробирку вносят 0, 4 мл 3 или 5 %-ного раствора уксусной кислоты, подкрашенного метиленовым синим (жидкость Тюрка). Капиллярной пипеткой набирают 0, 02 мл крови, конец пипетки тщательно протирают вначале увлажненной, а затем сухой ватой или марлей. Переносят кровь в пробирку, осторожно выдувая. Пипетку ополаскивают жидкостью Тюрка. Кровь в пробирке тщательно перемешивают, закрывают и оставляют стоять на 4 мин, периодически перемешивая содержимое. Счетную камеру предварительно тщательно обезжиривают спиртом, промывают дистиллированной водой и высушивают под феном, протирают мягкой фланелью.
3. Подсчет форменных элементов крови Чистое сухое покровное стекло притирают к камере так, чтобы появились радужные кольца. Кровь в пробирке снова перемешивают стеклянной палочкой, берут каплю крови и наносят к краю покровного стекла камеры. Подсчитывают лейкоциты через 1 мин после заполнения камеры, когда осядут клетки крови, пользуясь малым увеличением микроскопа при затемненном поле, для чего опускают конденсор или суживают диафрагму. Подсчитывают лейкоциты в 100 больших (1600 малых) квадратах. Расчет. Подсчитанное в 100 больших квадратах число клеток умножают на 50 (разведение крови 1 : 20), получают окончательный результат в тысячах в 1 мкл. Для подсчета клеток в 1 л количество лейкоцитов в 1 мкл умножают на 1000 (109/л). При подсчете лейкоцитов в камере соблюдают все те же правила, которые изложены в методике подсчета эритроцитов. Ошибка при подсчете составляет в среднем ± 7
3. Подсчет форменных элементов крови Тромбоциты (кровяные пластинки) – образования овальной или округлой формы диаметром 2 -4 мкм. Морфологически в них различают периферическую – беззернистую часть и внутреннюю, содержащую небольшое количество гранул. Тромбоциты участвуют почти во всех фазах свертывания крови, уменьшают проницаемость капилляров, способствуют местному спазму кровеносных сосудов. Подсчитывают тромбоциты или в мазке крови, или в камере Горяева. Ход опыта: 1. В меланжер для эритроцитов обычным способом набрать кровь до метки 0, 5 и разбавить ее в 200 разбавителем для тромбоцитов. Отложить меланжер на 10 мин, чтобы тромбоциты прокрасились метиленовой синью. 2. Повторно перемешать раствор и заполнить камеру Горяева обычным способом.
3. Подсчет форменных элементов крови 3. Произвести подсчет тромбоцитов под средним увеличением (х15 – х40) микроскопа в 25 больших квадратах сетки. Тромбоциты распределяются в камере равномерно между эритроцитами и имеют вид голубоватых глыбок. Количество тромбоцитов в 1 мм 3 крови согласно формуле а • 4000 • 200/1400 Примечание. Количество тромбоцитов можно определить и «сухим» методом в окрашенном по Романовскому-Гимзе мазке крови. Подсчитывают под иммерсией число пластинок, приходящихся на 1000 эритроцитов.
3. Подсчет форменных элементов крови Гемоглобин (Hb) – дыхательный пигмент крови, содержащийся в эритроцитах. Он состоит из белковой части – глобина и простетичеекой группы – гема, содержащего железо. Hb – коллоид с высоким молекулярным весом (около 70 000); через оболочку эритроцитов он не проходит. Образует с кислородом непрочное и легко диссоциирующее соединение – оксигемоглобин. Гемоглобин является основным переносчиком кислорода к тканям. В крови эмбрионов и отчасти молодых животных содержится наряду с гемоглобином взрослых и так называемый фетальный гемоглобин. Содержание Hb в крови зависит от вида, возраста, пола и состояния здоровья животных. Поэтому определение Hb является важной составной частью клинического анализа крови. Основным методом определения количества гемоглобина является колориметрический.
3. Подсчет форменных элементов крови Для визуальной колориметрии используют: гемометр ГС-3, электрофотоколориметр ФЭК-М, или гемоглобинометр фотоэлектрический ГФ-2. Ход определения. В пробирку вносят 5 мл трансформирующего раствора и 0, 02 мл крови (разведение в 251 раз), хорошо перемешивают, по истечении 10 мин смесь измеряют на фотоэлектроколориметре при длине волны 500— 560 нм в кювете с толщиной слоя 1 см против холостой пробы. Стандартный раствор измеряют при тех же условиях, что и опытную пробу. Расчет гемоглобина (г%) проводят по формуле: Нb = Еоп/Ест * 15, где Еоп — экстинкция опытной пробы; Ест — экстинкция стандартного раствора; 15 — соответствие стандартного раствора концентрации гемоглобина крови при ее разведении в 251 раз. Для перевода г% в г/л найденное число умножают на 10.
3. Подсчет форменных элементов крови Метод Сали, предложенный еще в 1895 г. , неточен и им в настоящее время пользоваться не рекомендуется. Определение гемоглобина в крови возможно с помощью бумажных полосок, помещенных на пластиковых подложках в отражательные фотометры, выпускаемых фирмами «Эймс» (США) и др. Исследуемую пробу наносят на реакционную зону диагностической полоски и помещают в прибор, в котором она облучается полихроматическим светом, диффузионноотраженный свет собирается на измерительной системе и после прохождения через интерферирующий фильтр измеряется, затем его сравнивают со стандартом. Система контролируется микропроцессором.
3. Приготовление, окрашивания и исследования мазков крови Мазки крови готовят на предварительно подготовленных обезжиренных предметных стеклах. Берут за ребра (а не за поверхность) предметное стекло и, отступая 1, 5— 2 см от узкого конца, наносят на него небольшую каплю крови. Шлифовальным стеклом, которое несколько уже, чем предметное, на которое нанесена капля крови, размазывают последнюю. Для этого шлифовальное стекло узким краем ставят под углом 45 е слева от капли, слегка подвигают его вправо, чтобы провести с ней соприкосновение, выжидают, пока капля расплывется по всему ребру, и легким быстрым движением ведут стекло справа налево, пока капля будет исчерпана. Мазок тотчас сушат на воздухе. На сухом мазке по его середине иглой пишут номер или кличку животного, при необходимости и дату взятия крови.
3. Приготовление, окрашивания и исследования мазков крови Фиксация мазков. Фиксирующая жидкость вызывает коагуляцию белка и прикрепляет клетку к стеклу. Фиксация придает форменным элементам крови стойкость по отношению к содержащейся в краске воде и препятствует деформации эритроцитов и лейкоцитов. Фиксированные сухие мазки помещают в контейнер, который опускают в кювету с рабочим раствором красителя и выдерживают в нем строго определенное время. Существует множество способов окраски мазков крови: окраска по Нохту, Паппенгейму, Май. Грюнвальду, Романовскому—Гимзе. Затем контейнер переносят в кювету с водопроводной водой. После этого мазки ставят вертикально в штатив для сушки. Микроскопическое исследование мазков крови. Просматривают мазок крови под малым увеличением микро-скопа (объектив х 10, окуляр х7).
3. Приготовление, окрашивания и исследования мазков крови Подсчет лейкоцитов и оценка морфологии эритроцитов допустимы только в тонкой части мазка, где эритроциты лежат одиночно, а не сложены в «монетные столбики» . На край мазка помещают каплю иммерсионного масла, переводят на иммерсионный объектив (х90). Лейкоциты подсчитывают по зигзагу (по линии «Меандра» ), отступя 2— 3 поля зрения от верхнего края мазка, в начале в 3— 5 полях зрения вдоль края мазка, затем в 3— 5 полях зрения под прямым углом к середине мазка, потом в 3— 5 полях зрения параллельно краю мазка и вновь под углом 90° возвращаются к краю мазка. Такое движение продолжают до тех пор, пока не будет сосчитана половина клеток, необходимая для выведения лейкограммы. Затем переходят на противоположную сторону мазка и подсчитывают вторую половину клеток. Подсчитывают только целые (неразрушенные) клетки.
3. Приготовление, окрашивания и исследования мазков крови В норме в крови выявляются лейкоциты следующих форм: базофилы, эозинофилы, нейтрофилы палочкоядерные и сегментоядерные, лимфоциты, моноциты. При наличии в мазках крови плазматических клеток, незрелых, бластных и труднодифференцируемых форм лейкоцитов их также вводят в лейкограмму, описывают их морфологию. Одновременно с выведением лейкограммы оценивают морфологию лейкоцитов. Если в анализе крови не было выявлено отклонений от нормы количественного состава форменных элементов крови, а при подсчете 100 лейкоцитов не обнаружено никаких отклонений от нормы ни в лейкограмме, ни в морфологии лейкоцитов, то можно ограничиться подсчетом 100 клеток. Если при этом были выявлены какие-либо отклонения от нормы, то необходимо подсчитывать не менее 200 лейкоцитов.
3. Приготовление, окрашивания и исследования мазков крови Лейкограмма дает представление только об относительных величинах. Более объективное представление о составе лейкоцитов крови дает вычисление их абсолютного количества, т. е. содержание каждого вида лейкоцитов в определенном объеме крови. Для подсчета эритроцитов и лейкоцитов крови, их дифференцировки можно пользоваться поточными автоматическими гематологическими цитометрами. Эти приборы позволяют определять гематокрит; количество эритроцитов; рассчитать среднее содержание гемоглобина в эритроците, т. е. отношение концентрации гемоглобина (г/л) к числу эритроцитов крови (МСН); среднюю концентрацию гемоглобина в эритроците, т. е. отношение концентрации гемоглобина (г/л) к величине гематокрита (л/л) (МСНС); выделить различные группы клеточных элементов, отличающихся не только по размеру, но и по зернистости.
3. Приготовление, окрашивания и исследования мазков крови Анализаторы типа STKS позволяют подсчитать общее количество лейкоцитов и построить их гистограмму, выделить лимфоциты, моноциты, эозинофилы, гра-нулоциты, а также нетипичные клетки (ядерные эритроциты, сгустки тромбоцитов, лимфобластов, гранулоцитов). Различные фирмы выпускают автоматические гематологические анализаторы: Н 6000, HI и Н 2 (фирма «Technicon» ), STKS ( «Coulter» ), NE 8000 ( «ТОА» ), «Sysmex» , Cell-Dyn 3000 ( «Abbott» ), Codas Aigoss 5 Diff ( «Roche» ) и др. Подсчет количества лейкоцитов требует применения в качестве антикоагулянта этилендиаминтетрауксусной кислоты (трилона В), так как гепарин может интерферировать с лизирующими клетками реагента.
3. Приготовление, окрашивания и исследования мазков крови Таблица 1. Лейкоцитарная формула Показатели Лощадь КРС Овцы Свиньи Кролики Птица Рыбы Пушные звери Базофилы 0, 5 1, 0 2, 0 1. 0 0, 5 Эозинофилы 4, 0 6, 5 7, 5 2. 0 2, 0 8, 0 — 4, 5 Палочкоядерные нейтрофилы 4, 5 3, 0 4, 0 7, 0 — — 5, 0 Сегментоядерные нейтрофилы 54 28 40 44 36 30 — 43 Лимфоциты 34 57 45 45 52 54 94 45 Моноциты 3, 0 4, 5 2, 0 6, 0 5, 0 2, 0
3. Приготовление, окрашивания и исследования мазков крови
Скачать презентацию Лабораторное занятие 6 по дисциплине Лабораторная диагностика
Лаб. д-ка тема 6.pptx