Лабораторное обеспечение службы крови И.

Лабораторное обеспечение службы крови И. А Новикова.

Основные осложнения гемотрансфузионной терапии 1. Сенсибилизация HLA и реакция гистонесовместимости 2. Посттрансфузионная иммуносупрессия 3. Реакция трансплантат против хозяина 4. Гемо -трансмиссивные инфекции

Обеспечение гистосовместимости донора и реципиента Иммунологический подбор совместимых пар «донор—реципиент» включает исследования: 1) эритроцитарных антигенов и антиэритроцитарных антител; 2) лейкоцитарных антигенов и антилейкоцитарных антител; 3) антигенов сывороточных белков и антител к ним; 4) комплекс серологических проб на совместимость между клетками и сывороткой крови исследуемой пары

Антигены HLA I класса – на мембранах всех ядросодержащих клеток. Экспрессия тканеспецифична. Максимальная экспрессия выявлена на лимфоидной ткани HLA II класса – преимущественно на АПК и иммунокомпетентных клетках Результат антигенной несовместимости донора и реципиента по антигенам HLA - сенсибилизация и развитие реакций по типу ГЗТ, рефрактерность к препаратам. Клинические последствия - посттрансфузионные реакции негемолитического типа. Наиболее часто возникает сенсибилизация к широко распространенным и высокоиммуногенным антигенам: HLA-A 2, В 5, В 35, DR 2, DR 3, DR 5. Профилактика - использование компонентов крови от гистосовместимых доноров

Анти- HLA –сенсибилизация 1. Естественная - у женщин во время беременности к аллоантигенам плода. Частота аллосенсибилизации при беременности составляет от 5 до 25 %. Специфичность формирующихся антител широкая, чаще анти-В, чем анти-А. 2. При гемотрансфузиях - обусловлена примесью лимфоцитов, содержащихся в большинстве гемокомпонентов. Пороговая величина иммуногенной нагрузки - 5 млн лимфоцитов. Анти - HLA антитела отмечены, начиная с 6 гемотрансфузий. При 20 гемотрансфузиях около 50% больных сенсибилизированны к HLA. Практически свободны от этой примеси только размороженные криоконсервированные эритроциты. Степень аллосенсибилизации зависит от состояния иммунной системы реципиента

Методы подбора гистосовместимых доноров 1. Фенотипирование лимфоцитов HLA I класса - с помощью набора гистотипирующих сывороток в микролимфоцитотоксическом тесте. Набор сывороток, определяющих антигены А, В и С локусов системы HLA, должен выявлять не менее 30 наиболее часто встречающихся и редких антигенов системы HLA. Недостаток - недостаточная надежность (доля ошибочных результатов до 20— 25 % ). HLA II класса - с помощью гомозиготных типирующих клеток в тесте смешанной культуры лимфоцитов. 2. Серологические пробы на индивидуальную совместимость по аллоантигенам лейкоцитов, тромбоцитов и иммуноглобулинов (реакции лейкоцитоагглютинации и тромбоцитоагглютинации в двух вариантах: исследование сыворотки реципиента с клетками крови донора и сыворотки донора с форменными элементами реципиента. 3. HLA-генотипирование с помощью молекулярно- биологических методо

Этапы проведения лимфоцитотоксического теста 1. Выделение лимфоцитов Взятие венозной крови, дефибринирование. Разделение на градиенте плотности фиколла - верографина (1076 -1078) Отмывание полученной взвеси мононуклеаров раствором Хенкса Приготовление красителя (раствор трипанового синего с эозином) 2. Получение комплемента (используют пул сывороток кролика, хранение при -196 10 -12 месяцев, не размораживая).

Этапы проведения лимфоцитотоксического теста (продолжение) 1. Постановка реакции: в лунки микрокамеры (типа Терасаки ), заполненные вазелиновым маслом (для предотвращения высыхания) вносят в равных объемах стандартные анти -HLA сыворотки и исследуемые лимфоциты, инкубируют при 22°С 30 мин, добавляют комплемент и инкубируют при 22°С 60 мин. Затем добавляют краситель на 3 минуты, стряхивают. Учет непосредственно в лунках при микроскопировании , ув. 10 х15. Подсчитывают число погибших (прокрашенных) лимфоцитов. 0— 10% (-) — отрицательная реакция 15— 20% (+) — реакция слабоположительная 20 — 39 % (2+) — реакция положительная 40 — 79 % (3+) — реакция отчетливо положительная 80 — 100 % (4+) — реакция резко положительная

Реакция смешанной культуры лимфоцитов (СКЛ) Показания: оценка совместимости донора и реципиента при переливании гемотрансфузионных средств, содержащих значительное количество аллогенных лимфоцитов иммунокомпрометированным реципиентам. Выявляет детерминанты HLA-D локуса. Преимущества: позволяет судить о степени совместимости пары донор—реципиент, независимо от количества выявленных антигенов и их принадлежности к главному комплексу гистосовместимости (благодаря тесному сцеплению антигенов локуса D с другими локусами системы HLA).

Основные этапы реакции СКЛ 1. Выделение лимфоцитов v Взятие венозной крови (дефибринирование или с гепарином). v Разделение на градиенте плотности фиколла - верографина (1076 - 1078) v Приготовление суспензии мононуклеаров в питательной среде (среда 199, сыворотка эмбрионов коров) 2. Лимфоциты стимулирующей популяции (СП) облучают на Y- облучателе «ИПК» (137 Cs) или обрабатывают митомицином С 3. Смешивают отвечающие (ОП) и стимулирующие лимфоциты, инкубируют 5 суток при 37°С в атмосфере 5 % СО 2. 4. Удаляют надосадочную жидкость и учитывают результаты: v мазки →фиксация в метаноле 15 мин→ окраска по Романовскому → подсчет бластов. Отрицательный результат – до 15% лимфоцитов с признаками трансформации в бласты. v использование радиационной метки (Н 3 -тимидин) → измерение радиоактивности проб на β-счетчике. Индекс стимуляции (ИС): величина синтеза ДНК (имп/мин) при стимуляции аллогенными лимфоцитами/величина синтеза ДНК этими же лимфоцитами при стимуляции аутологичными лимфоцитами

Посттрансфузионная иммуносупрессия Провоцирующие факторы: Ø Высокая доза антигенов, одновременно обладающих аллогенными и идентичными организму реципиента детерминантами. Ø Длительная персистенция антигена Ø Представление антигена неспециализированными клетками (специализированные преимущественно в коже и слизистых оболочках).

Механизмы посттрансфузионной иммуносупрессии v Распознавание аллогенных детерминант → образование диссоциирующих иммунных комплексов → изменение функционального состояния макрофагов (дополнительный фактор – перегрузка солями железа) → ↑ синтеза ПГЕ → ↑ внутриклеточный ц. АМФ → ↓ пролиферации лимфоцитов, секреции лимфокинов (ИЛ-1, 2 и др. ) и экспрессии HLA-антигенов II класса на АПК. v Влияние плазменных продуктов с иммуносупрессивным действием (растворимые HLA-антигены, фермент трансглутаминаза - фибринстабилизирующий фактор, или фактор XIII, альфа-макроглобулин). v Физиологические эффекты цитокинов, накапливающихся в процессе хранения в контейнерах с гемокомпонентами

Клинические проявления посттрансфузионной иммуносупрессии Ø Инфекционный синдром: возрастание частоты послеоперационных инфекционных осложнений при переливании аллогенной крови (с 5% до 30%), генерализация латентных инфекций Ø Аллергический синдром Ø Аутоиммунный синдром Ø Лимфопролифертивный синдром

Профилактика посттрансфузионной иммуносупрессии Ø выбор оптимальных и подбор гистосовместимых гемокомпонентов; Ø преимущественное использование аутологичных гемокомпонентов; Ø максимальное удаление лейкоцитов из трансфузионных сред; Ø диагностический мониторинг функционального состояния иммунитета

Болезнь «трансплантат против хозяина» (РТПХ) Условия развития: v иммунодефицит у реципиента v высокое содержание иммунокомпетентных клеток в трансфузионной среде. Клинические проявления - острая форма (встречается чаще) - гипертермия , продолжающаяся от 24— 48 ч, диффузная кожная сыпь. Типичное начало — 2— 30 -й день (чаще на 7— 14 -й день) после трансфузии, дисфункция ЖКТ и печени

Болезнь «трансплантат против хозяина» (продолжение) Пациенты, наиболее подверженные РПТХ: v новорожденные, v дети и подростки с врожденными иммунодефицитами Факторы риска развития РТПХ: v трансфузии свежей крови, v кардиохирургические операции, v злокачественные новообразования, v принадлежность к мужскому полу. Из верифицированных случаев РТРХ 39 % - у кардиохирургических и 36 % — у онкологических пациентов.

Болезнь «трансплантат против хозяина» (продолжение) Диагностика РТПХ: Ø биопсия кожи Ø HLA - типирование реципиента, донора Ø уровень содержания молекул межклеточной адгезии (повышается) Профилактика РТПХ: Ø гамма-облучение гемокомпонентов для подавления пролиферации Т-лимфоцитов Ø очищающие фильтры для удаления лейкоцитов из трансфузионной среды Ø использование гемокомпонентов , хранившихся более 15 суток ?

БЛАГОДАРЮ ЗА ВНИМАНИЕ !!!