Лабораторная диагностика вирусных инфекций М. В. Таблер Зав. ЛООВИ ФГУЗ ФЦГи. Э Роспотребнадзора
Вирусологические методы Классические методы Индикация, изоляция и идентификация вирусов
Индикация вирусов и выделение вирусов Обнаружение вирусов, вирусных антигенов, вирусной РНК или ДНК, а в некоторых случаях- характерных патологических изменений или специфических включений (например тельца Бабеша-Негри в ткани мозга при бешенстве) обеспечивают необходимую информацию. Полученные данные помогают расшифровать этиологию заболевания, установить циркуляцию вирусов, определить санитарное состояние территории. В качестве лабораторных моделей для выделения вируса из клинического материала используют новорожденных и взрослых белых мышей, морских свинок, белых крыс, сирийских хомячков, обезьян, куриные и утиные эмбрионы. Различные виды перевиваемых клеточных культур: почки сирийских хомячков, поросят, обезьян, первичные культуры фибробластов эмбрионов человека, кур и т. д.
Результатом заражения вируссодержащим материалом клеточных культур может быть развитие цитопатического действия, образование бляшек под агаровым покрытием. Для индикации вирусов применяют серологические методы с использованием поли или моноклональных антител, меченных ферментами. Наибольшее применение имеют ИФА, РНГА. Для детекции РНК широко применяется ОТ- ПЦР и ПЦР в реальном времени.
Идентификация вирусов После выделения штаммов проводится их изучение и идентификация. Процесс идентификации предусматривает определение семейства, рода, антигенной группы. Несерологические методы идентификации: электронная микроскопия позволяет по морфологическим критериям отнести изучаемый вирус к определенному семейству. Важное значение имеют данные о патогенной, цитопатогенной и гемагглютинирующей активности выделенного агента, сведения о физико-химических характеристиках, определение типа нуклеиновой кислоты, способность проходить через мелкопористые фильтры. Эти исследования полезны при идентификации и классификации новых для науки вирусов, нетипирующихся в серологических реакциях.
Традиционными серологическими методами идентификации вирусов являются: РСК, РТГА, РДПА (диффузная преципитация в агаре), РН, МФА. Необходимым условием для проведения этой работы является наличие иммунных референс - сывороток. Обладающих группо -и видоспецифической активностью.
Принципы электронной микроскопии. Электронный микроскоп был создан в 1931 г. Конструкция ЭМ напоминает конструкцию светового, источником излучения является нить катода, испускающая электроны при ее нагреве. ЭМ не дает возможности полностью описать молекулярную структуру. Для исследования молекулярной структуры макромолекул на атомном уровне используют метод рентгеноструктурного анализа. Широкое применение нашли методы, основанные на криофиксации и использовании низких температур при подготовке биологического материала. Их основное преимущество: возможность исключения артефактов химической фиксации и сохранение таким образом пространственной структуры объекта. К ним относятся: метод замораживания - высушивания, криоскалывания, замораживания -замещения и т. д.
Для получения трехмерного изображения вируса используется сканирующий электронный микроскоп. Чтобы исследовать ультраструктуру внутри клетки необходимо сделать ультратонкий срез через исследуемый материал, затем его окрашивают.
Реакция биологической нейтрализации. РН основана на способности специфических антител вступать во взаимодействие с антигенными детерминантами белков оболочки вириона и нейтрализовать инфекционную активность вируса. РН является одной из наиболее специфических серологических реакций, используемых в вирусологии. В РН участвуют: вирус, сыворотки, содержащие вируснейтрализующие антитела и чувствительная биологическая модель (лабораторные животные или культуры клеток).
Вирус. Перед постановкой РН готовят активную вируссодержащую субстанцию, представляющую собой супернатант, полученный после центрифугирования исходной вируссодержащей суспензии. Сыворотка крови. С диагностической целью в РН исследуют парные стерильные сыворотки больных, взятые в первые дни заболевания и в период реконвалесценции. Для выявления сероконверсии парные сыворотки следует титровать одномоментно. Необходимо использовать заведомо положительные и отрицательные сыворотки. Тест-системы. В качестве тест-системы используют культуры клеток. В которых вирус вызывает выраженный цитопатический эффект или формирует бляшки под агаровым покрытием.
Постановка опыта нейтрализации. РН позволяет определять титры антител в сыворотках или индексы нейтрализации сывороток. Для расчета рабочего разведения вируса следует оттитровать вируссодержащий материал на культурах клеток, используя 10 кратные разведения вируса. Предельные разведения вируса, вызывающие 50% цитопатический эффект в лунках с культурами клеток, считают одной инфекционной дозой. Учет результатов. При учете РН в культурах клеток титром антител считается наибольшее разведение сыворотки при котором монослой клеток сохраняется не менее чем в 50% инфицированных лунках.
ИФА. ИФА применяется для выявления вирусспецифических антигенов, серологической диагностики вирусных инфекций, изучения иммуноструктуры населения. Принцип: специфические иммуноглобулины. Прикрепленные к поверхности лунок полистероловых планшетов, сорбируют антиген из исследуемого образца и образуют иммунный комплекс со специфическим конъюгатом, что выявляется затем при добавлении субстрат - индикаторного раствора. ИФА для определения авидности Jg. G. Этот метод основан на том, что в процессе формирования антител, развитии гуморального иммунитета при заболевании и выздоровлении пропорция специфических высокоавидных антител возрастает. Поэтому присутствие низкоавидных антител указывает на первичный характер инфекции, тогда как высокоавидные антитела типичны для предшествующего заболевания, реактивации инфекции или повторной инфекции.
Степень авидности выявляется при сравнительном определении их активности в сыворотках и выражается как индекс авидности. Он представляет собой соотношение сигнала обработанной мочевиной сыворотки к сигналу необработанной. Авидность менее 30% считается низкой и рассматривается как признак острой первичной инфекции. Высокая авдность более 50% указывает на анамнестический характер антител.
Метод флюоресцирующих антител. Феномен иммунофлюоресценции дает возможность выявлять специфический вирусный антиген в инфицированных клетках при обработке их меченными антителами. Существует два метода: прямой метод флюоресценции антител и непрямой. Прямой метод. На фиксированные ацетоном антигенсодержащие препараты наносят рабочее разведение содержащей специфические антитела сыворотки, меченной флюоресцирующим красителем. Специфическая реакция в виде свечения обнаруживается в том участке препарата, где произошла реакция антиген – антитело. Достоинства: относительная простота и высокая специфичность.
Непрямой метод. Включает два этапа постановки: Сначала неконъюгированная иммунная сыворотка реагирует с антигеном, а затем с образовавшимся комплексом вступает во взаимодействие конъюгированный антивидовой белок, специфичный в отношении вида – источника иммунной сыворотки. Достоинства: исключает необходимость конъюгирования каждой специфической иммунной сыворотки. Для проведения серологической идентификации достаточно иметь набор иммунных сывороток, полученных при иммунизации животных одного вида.
Молекулярно – генетические методы Процесс репликации ДНК условно подразделяют на три основных этапа: инициацию, элонгацию и терминацию. Построение новой нити ДНК идет только в одном направлении: от 5‘ – конца к 3‘- концу. Путем присоединения новых нуклеотидов. Процесс репликации ДНК в клетке идентичен таковому в полимеразной цепной реакции, где достаточно повторяются принципы естественной репликации ДНК (расплетение спирали и расхождение нитей, присоединение праймеров и достраивание цепи дочерней нити).
На рубеже 90 -х годов прошлого столетия были разработаны следующие методы амплификации нуклеиновых кислот: - полимеразная цепная реакция ПЦР – 1983 -1989 гг. - лигазная реакция амплификации -1989 -1991 гг. - реакции транскрипционно - опосредованной амплификации -1989 -1991 гг. - амплификации с удалением (вытеснением) цепи -1992 г. Методы амплификации НК в зависимости от используемых температурных режимов и их цикличности подразделяются на: - методы амплификации с циклической сменой температурных параметров (ПЦР, лигазная цепная реакция) - изотермальные методы амплификации НК ( метод транскрипционно опосредованной амплификации, метод амплификации с вытеснением цепи и т. д. ) - методы, основанные на амплификации сигнала, при которой усиление сигнала каждой молекулы зонда происходит за счет использования сложных зондов или технологии разветвленной ДНК.
Полимеразная цепная реакция Принцип метода полимеразной цепной реакции был разработан Кэри Мюллисом в 1983 г. , удостоенный за это Нобелевской премии в области химии в 1993 г. Иногда ПЦР называют бесклеточным молекулярным клонированием. Простота исполнения, высокие показатели чувствительности и специфичности принесли новому методу небывалую популярность. За короткое время ПЦР - анализ распространился по всему миру, быстро выйдя из лабораторий НИИ в практическое здравоохранение. Что позволило ему превратиться в «диагностический инструмент нового тысячелетия» . На сегодняшний день ПЦР- анализ остается наиболее распространенной и динамично развивающейся технологией.
Принцип: В основе метода ПЦР лежит многоступенчатый циклический процесс репликации ДНК, включающий ряд последовательных стадий, составляющих трехступенчатый цикл амплификации ДНК: денатурацию(расплетение двойной спирали и расхождение нитей ДНК), отжиг праймеров и полимеризацию(элонгацию) цепей ДНК, протекающих при различных температурных режимах. Переход от одной стадии реакции к другой достигается изменением температуры в инкубируемой смеси. Данный метод обеспечивает многократное увеличение числа копий специфического участка ДНК, катализируемое ферментом ДНК – полимеразой. Данный процесс происходит в пробирке в циклическом режиме. Каждый цикл амплификации состоит из трех этапов, протекающих при различных температурных и временных режимах.
Вначале при нагревании амплификационной смеси до 93 -95 ºС происходит термическая денатурация ДНК, в результате которой двухнитевые сегменты ДНК разделяются на отдельные цепи. Следующий этап – комплементарное присоединение(отжиг) праймеров к комплементарным последовательностям на противоположных цепях ДНК. Отжиг протекает в соответствии с правилом комплементарности Чаргаффа, означающим, что в двухцепочечной молекуле ДНК напротив аденина всегда тимин, а напротив гуанина всегда – цитозин. Для каждой пары праймеров существует своя температура отжига, значения которой располагаются в интервале 37 -65ºС. Третий этап (элонгация) – комплементарное достраивание цепей ДНК, которое происходит от 5‘-конца к 3‘- концу цепи в противоположных направлениях, начиная с участков присоединения праймеров. Материалом для синтеза новых цепей служат добавляемые в раствор дезоксирибонуклеозидтрифосфаты. Процесс синтеза катализируется ферментом ДНК- полимеразой и происходит при температуре 70 -72 ºС.
Образовавшиеся в первом цикле амплификации новые цепи ДНК служат матрицами второго цикла амплификации, в котором происходит образование специфического фрагмента ДНК – ампликона, размер которого ограничен праймерами. В последующих циклах амплификации ампликоны служат матрицей для синтеза новых цепей. Таким образом происходит экспоненциальное (в геометрической прогрессии) накопление специфических ампликонов. Рост количества ампликонов ограничен количеством реагента, присутствием ингибиторов, образованием побочных продуктов амплификации. На последних циклах реакции рост замедляется , это называют «эффектом плато» . Чем меньше начальная концентрация ДНК – мишени, тем выше риск выхода реакции на плато. Этот момент может наступить до того, как количество специфических продуктов амплификации будет достаточно, чтобы их проанализировать. Избежать этого позволяет оптимизация условий протекания реакции амплификации.
Разновидности и форматы реакции. ПЦР с «горячим» стартом. Суть реакции состоит в предотвращении возможности начала реакции до момента достижения в пробирке условий, обеспечивающих специфический отжиг, позволяющих уменьшить риск образования неспецифических продуктов амплификации. Во время подготовки ПЦР – смеси возможно образование неспецифических димеров. Существует два подхода. Первый из них подразумевает физическое разделение компонентов реакции (например. при помощи воска, при этом в нижней части реакционной смеси находятся праймеры, а верхней части – Tag – полимераза и ДНК – мишень. Второй – использование модифицированных ДНК – полимераз и моноклональных антител к ним. Фермент, связанный с моноклональными антителами становится активным лишь после стадии первой денатурации, когда моноклональные АТ необратимо денатурируют и освобождают активные центры ДНК – полимеразы.
Мультиплексная ПЦР. Позволяет осуществлять одномоментную диагностику различных видов возбудителей используя несколько пар праймеров, проводя амплификацию нескольких ДНК – матриц в одной пробирке. К недостаткам этого метода можно отнести более низкую чувствительность, а также сложность интерпретации результатов. Гнездовая ПЦР. Используется для уменьшения числа побочных продуктов реакции, повышения чувствительности и специфичности, благодаря использованию двух пар праймеров, специфичных в отношении ДНК – мишени и проведения двух последовательных реакций ПЦР. Вначале осуществляют амплификацию определенного фрагмента ДНК с помощью внешних праймеров. Небольшое количество образовавшегося продукта амплификации. В результате первого этапа используют в качестве матрицы на втором этапе амплификации. Вторая пара внутренних праймеров амплифицирует участок ДНК внутри продукта первой реакции амплификации. Недостатком данного метода является высокий риск контаминации.
Существует еще много разнообразных видов ПЦР : аллельспецифическая – используется при обнаружении мутаций в геномной ДНК, который позволяет находить небольшое число мутантных ДНК. Метод молекулярных колоний в геле, ПЦР с произвольными праймерами, ПЦР с обратной дот-блот-гибридизационной детекцией на стрипах и т. д. (для науки). ПЦР с обратной транскрипцией. Используется для амплификации, выделения и идентификации РНК. Вначале проводят на матрице РНК синтез одноцепочечной молекулы к. ДНК с помощью фермента ревертазы, которая дальше используется для постановки классической ПЦР. В 1991 г. Маерсом и Гельфандом был охарактеризован термостабильный фермент – ДНК – зависимая ДНК – полимераза, выделенная из Thermus thermophilus , которая катализирует синтез на РНК к. ДНК, проявляя при этом активность РНК – зависимой ДНК – полимеразы. В присутствии ионов Mg у неё проявляется активность обычной ДНК – полимеразы. Благодаря этим свойствам, фермент используется для одновременного проведения обратной транскрипции и амплификации в одной пробирке.
ПЦР с детекцией продукта амплификации в режиме реального времени. Метод основан на количественной флюоресцентногибридизационной детекции специфических продуктов амплификации, в которой флуоресцентная молекула (интеркалирующий двухцепочечную ДНК краситель) используется для наблюдения за развитием реакции амплификации, а увеличение интенсивности флуоресценции прямо пропорционально увеличению количества ампликонов. Распознавание положительных образцов осуществляют с помощью алгоритмов компьютерной программы, которая анализирует изменение флуоресценции в каждом цикле. Данный метод имеет ряд преимуществ по - сравнению с традиционной ПЦР. Амплификация и анализ продукта осуществляется одновременно в процессе реального времени. Отсутствует пост – обработка продуктов амплификации, переноса образца, проведения электрофореза, что ведет к снижению риска контаминации лаборатории (менее жесткие требования к организации ПЦР – лаборатории).
Данный метод дает возможность проведения количественного анализа и необходимое количество исходной ДНК в 1000 раз меньше, чем при классической ПЦР. Данная реакция занимает меньше времени, более специфична, чувствительна и воспроизводима, чем традиционная ПЦР. В тоже время она не идеальна для мультиплексной ПЦР, ее постановка требует высоких технических навыков, высока стоимость оборудования.
Методы детекции продуктов амплификации. Электрофоретический метод детекции в агарозном (пилиакриламидном) геле. Электрофорез – метод разделения заряженных молекул в пористом геле. В основе эл. фореза лежат два физических явления: ДНК имеет отрицательный заряд, следовательно, в электрическом поле движется от «-» к «+» , размер молекулы ДНК определяет ее подвижность в агарозном геле. Различают следующие типы электрофоретического разделения ДНК: - горизонтальный электрофорез в агарозном геле. - Вертикальный электрофорез в полиакриламидном геле. Его проводят в специальной камере, он имеет большую разрешающую способность по сравнению с агарозным гелем и позволяет различать молекулы ДНК с точностью до одного нуклеотида.
В клинической лабораторной практике амплифицированный фрагмент ДНК наиболее часто выявляют методом горизонтального электрофореза в агарозном геле в присутствии интеркалирующего с ДНК флуоресцентного красителя (бромистого этидия). Данный краситель образует с фрагментами ДНК устойчивое соединение, проявляющееся в виде светящихся полос при облучении геля УФизлучением. Учет результатов происходит с использованием трансиллюминатора. Размер ампликона оценивают, сравнивая его пробег с пробегом молекул ДНК известной длины. Для регистрации результатов гель фотографируют на пленку или регистрируют с помощью видеосистемы, связанной с компьютером. , находящемся в локальной сети, что позволяет передавать изображение в чистую зону, для исключения контаминации. Данный способ прост в исполнении, но его недостатки: субъективность результатов, недостаточное разрешение, возможность контаминации, отсутствие автоматизации.
Гибридизационно - ферментный метод детекции (ГИФА). В основе данного метода лежит реакция гибридизации олигонуклеотидных зондов с продуктами амплификации, содержащими ту или иную метку, детектируемую специальными приборами. Чаще всего используют планшетный формат и систему детекции аналогичную ИФА. Используют праймеры, меченные биотином, в результате чего меченным оказывается и продукт амплификации. На стадии детекции биотин прочно связывается с авидином, входящим в состав коньюгата, меченного пероксидазой хрена. Далее все как при ИФА. Достоинства: объективность, возможность проведения количественного анализа, возможность использования оборудования для ИФА, автоматизация процесса. Недостатки: высокий риск контаминации. Высокие значения фонового сигнала, низкие значения оптического сигнала у положительных образцов.
Гибридизационно – флуоресцентный метод детекции в режиме реального времени или по конечной точке. Использование флуоресцентно – меченных зондов, позволяет оценить накопление специфического продукта амплификации по увеличению уровня флуоресцентного сигнала в режиме реального времени или после окончания реакции (анализ по конечной точке). В первом случае можно провести количественную оценку накопления специфического продукта после каждого цикла и построить по этим данным кинетическую кривую. Во втором случае – можно дать только качественную оценку. При данном методе детекции по мере накопления продуктов амплификации происходит синхронное увеличение флуоресцентного сигнала, который детектируется в соответствующем термоциклере. При детекции по конечной точке саму реакцию амплификации можно проводить в обычном амплификаторе. Анализ продуктов амплификации осуществляется без извлечения ампликонов из пробирок, что позволяет отказаться от стадии электрофореза. Флуоресцентная детекция в 2 -3 раза чувствительнее электрофорезной детекции.
Детекция в реальном времени идет с применением интеркалирующих флуоресцентных красителей, активирующих способность к флуоресценции в результате их внедрения в двухцепочечные молекулы ДНК. Используют SYBR Green I. Краситель не связанный с ДНК, обнаруживает слабую флуоресценцию в растворе, которая возрастает в результате связывания по мере элонгации. Таким образом, с каждым последующим шагом амплификации можно детектировать все более сильный флуоресцентный сигнал.
Основные компоненты ПЦР. ДНК – матрица – ДНК или ее часть, содержащая искомый специфический фрагмент. Для выделения НК в молекулярной диагностике используют различный клинический биологический материал: сыворотку, кровь, плазму, мочу, сперму, фекалии, спж, мокроту, грудное молоко, секрет предстательной железы, суспензии клеток, гомогенаты тканей. Кроме этого, образцами для проведения молекулярно-диагностических исследований могут служить и объекты окружающей среды – вода. Почва, растительная ткань, сухие пятна крови, насекомые в янтаре, мумии, кости, клеточные культуры. Качество и количество ДНК являются важными факторами для ПЦР. При отсутствии ДНК – мишени специфический продукт амплификации не образуется. Для обнаружения возбудителя образец должен содержать по меньшей мере одну полноразмерную копию исследуемой нуклеотидной последовательности.
-Праймеры, синтетические олигонуклеотиды, комплементарные последовательностям ДНК на границах определяемого фрагмента, а также зонды. - Термостабильная ДНК – полимераза, фермент, который катализирует реакцию полимеризации. Первая термостабильная ДНК – полимераза была выделена в 1976 г. от термофильной бактерии, живущей в горячих источниках. Она выдерживает высокую температуру на всех этапах амплификации без потери своей активности. Высокий температурный режим позволяет подбирать более жесткие температурные условия отжига, обеспечивая повышение чувствительности и специфичности реакции. - Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов является строительным материалом для ДНК – полимеразы при проведении ПЦР. Оптимально подобранные их концентрации обеспечивают высокую точность синтеза амплифицируемого фрагмента. - Соли Mg источники ионов, необходимых для поддержания активности ДНК – полимеразы.
Методы выделения ДНК и РНК. Целью всех методов экстракции НК является удаление белков, ДНК, РНК, изоляция специфической ДНК. Основными требованиями, предъявляемыми к методам, являются: низкая трудоемкость и быстрота выполнения процедуры, максимальное удаление ингибиторов ПЦР, минимизация потерь НК , низкий риск перекрестных контаминаций. Способы выделения НК зависят от вида исследуемого материала, от его природы. Современные методы выделения состоят из трех этапов: разрушение (лизис) клеток, инактивация нуклеаз и собственно очистка. Наиболее широко используемыми подходами в методиках очистки НК являются: - использование детергентов для разрушения клеточных стенок и растворения белков; - необратимая инактивация белков путем денатурации.
Один из популярных методов выделения ДНК основан на использовании для лизиса клеток сильного хаотропного агента- гуанидина тиоцината и последующей сорбции ДНК на носителе. После серии отмывок в пробе остается ДНК, сорбированная на носителе (частицы двуокиси кремния), с которого она легко снимается с помощью элюирующего буфера. Метод удобен и прост, но возможны потери ДНК вследствие необратимой сорбции и нескольких отмывок. Другая группа выделения основана на использовании аффинных ионообменников, которые, в отличие от двуокиси кремния, сорбируют не ДНК, а, наоборот, примеси, мешающие реакции.
Автоматизация процессов выделения ДНК и РНК. Эффективность выделения ДНК и РНК значительно повышается, если использовать для этой цели специальные приборы – риболайзеры. Снижение количества ручных операций ведет к увеличению производительности, сокращению времени. снижению риска перекрестной контаминации, стандартизации процесса выделения и снижению вероятности появления ошибок в работе оператора. Использование автоматических систем особенно полезно при выделении РНК, которая быстро инактивируется под влиянием различных РНКаз. Ручные операции в автоматической системе сведены только к загрузке образцов, реактивов и расходных материалов в экстрактор. Система обеспечивает высокопроизводительную автоматическую экстракцию (24 экстракции за 40 -60 минут).
Диагностическая эффективность. Применение. 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Метод ПЦР нашел применение в различных областях науки, медицины и практической деятельности человека. ПЦР применяется для: Диагностики и мониторинга эффективности лечения инфекционных заболеваний бактериальной и вирусной природы у человека в том числе труднокультивируемыми и некультивируемыми возбудителями. Молекулярно – биологической диагностики грибковых и паразитарных заболеваний. Биологического контроля препаратов крови (служба переливания крови). Экспресс - индикации патогенных биологических агентов в объектах окружающей среды. Молекулярной эпидемиологии. Определение устойчивости микрофлоры к антибактериальным препаратам, изучение генетических механизмов развития антибиотикоустойчивости. Пренатальной и неонатальной диагностики инфекционных заболеваний.
Основными достоинствами метода ПЦР являются: 1. Возможность проводить прямое обнаружение возбудителя. 2. Высокая специфичность до 99 -100%, обусловленная тем, что в исследуемом материале выявляется уникальный , характерный только для данного возбудителя фрагмент ДНК. 3. Универсальность процедуры выявления различных возбудителей, которая дает возможность из одной пробы диагностировать несколько возбудителей. 4. Простота и удобство проведения испытания, исключение этапа выращивания культуры. 5. Сравнительно небольшие затраты времени на проведение анализа. Унифицированный метод обработки материала и детекции продуктов реакции, автоматизация процесса дают возможность провести полный анализ за 4 – 4, 5 часа.
Имеется ряд ограничений: 1. Высокая стоимость оборудования. 2. Одновременная амплификация ДНК как живого, так и погибшего микроорганизма, что предполагает определенные требования при использовании ПЦР для определения эффективности лечения. 3. Возможность перекрестной реакции. Контаминация. 4. Вследствие изменчивости микроорганизмов некоторые генотипы исследуемого возбудителя могут мутировать в амплифицируемом участке генома, и таким образом, давать ложноотрицательные результаты. 5. совершенствование технологий амплификации приводит к появлению более сложных программ, приборов, для работы с которой требуется определенная техническая подготовка.
Другие методы амплификации. Лигазная цепная реакция (ЛГЦ) Данный метод амплификации был впервые описан в 1989 г. , В основе метода лежит способность специфического фермента ДНК – лигазы восстанавливать фосфодиэфирные связи в одноцепочечных разрывах двухцепочечных молекул ДНК. В настоящее время реакция имеет только ретроспективное значение. Выпуск наборов прекращен в связи с большей конкурентностью наборов, разработанных на основе ПЦР.
Изотермические реакции амплификации. В отличие от циклических реакций (ПЦР и ЛЦР) проходят без смены температур и при более низких значениях. Например NASBA при 41ºС, SDA при + 37ºС, что позволяет отказаться от термоамплификаторов и использовать водяные бани или лабораторные термостаты. Методы транскрипционно - опосредованной амплификации (NASBA, TMA, TAS). Принципы их протекания похожи друг на друга и отличаются незначительно. Данные методы являются следующим поколением технологий амплификации НК. В основу транкрипционноопосредованной амплификации положена методика, моделирующая репликацию ретровирусов, где в качестве мишени служит одноцепочечная молекула РНК.
Метод NASBA. Был разработан в 1991 г. Эта технология может быть использована для продолжительной амплификации НК в одной смеси и при одной температуре. Мишенью для NASBA служат молекулы рибосомальной РНК. Метод основан на взаимодействии трех ферментов: обратной транскриптазы вируса миобластомы птиц, РНКазы и ДНК – зависимой – РНК – полимеразы при постоянной температуре в 41ºС. Продукты реакции детектируются электрохемилюминесценцией в результате гибридизации с меченными зондами. Существует NASBA в реальном времени. Существуют еще несколько методов: Метод амплификации с удалением (вытеснением) цепи. В основе метода лежит способность некоторых рестриктаз делать сайт – специфический одноцепочечный разрыв в определенном месте, а также свойство ДНК – полимеразы инициировать репликацию в области одноцепочечного разрыва в ДНК – мишени с последующим вытеснением разрезанной одноцепочечной ДНК из дуплекса вновь синтезируемой цепью ДНК.
Скачать презентацию Лабораторная диагностика вирусных инфекций М В Таблер Зав
Лабораторная диагностика вирусных инфекций.ppt