Лабораторная диагностика риккетсиозов Риккетсиозы группа трансмиссивных

Лабораторная диагностика риккетсиозов.

Риккетсиозы – группа трансмиссивных инфекционных заболеваний, которые вызываются внутриклеточными паразитами – риккетсиями и характеризуются рядом общих патогенетических, клинических и иммунологических свойств.

Риккетсии - самые мелкие бактерии (0, 30, 5 мкм в диаметре, 0, 8 -20, 0 мкм в длину) • Кокки, короткие и длинные палочковидные, нитевидные • Неподвижны в большинстве своем • Грамотрицательные, окрашиваются основным фуксином по методу Гимза • Спор не образуют • Размножаются внутриклеточно, преимущественно в эндотелии • На искусственных питательных средах не растут (культивируются на куриных эмбрионах или тканевых культурах) • Хозяином и переносчиком в природных условиях являются членистоногие (чаще всего клещи) • Большинство чувствительны к антибиотикам тетрациклиновой группы

Большинство видов риккетсий (свыше 40) непатогенны. Патогенные риккетсии относятся к отряду Rickettsiales, семейству Rickettsiaceae

Триб Rickettsieae подразделяется на 3 рода: • Rickettsia (возбудители почти всех риккетсиозов человека) • Rochalimea (возбудитель волынской, или окопной лихорадки и возбудитель клещевого пароксизмального риккетсиоза) • Coxiella (возбудитель лихорадки Ку)

Группы риккетсиозов • Группа сыпного тифа (эпидемический сыпной тиф, болезнь Брилла-Цинссера, лихорадка Цуцугамуши) • Группа пятнистых лихорадок (пятнистая лихорадка Скалистых гор, Марсельская лихорадка, клещевой сыпной тиф Северной Азии и др. ) • Прочие риккетсиозы (Ку лихорадка, эрлихиоз, волынская лихорадка и др. )

Нормативно-методическая документация: • МР № 15 -6/28 от 22. 10. 91 Эпидемиологический надзор за клещевым риккетсиозом. Иммунодиагностика заболевания. Методы выявления возбудителя. • МУ № 342 1998 г Серологические методы диагностики эпидемического сыпного тифа и болезни Брилла-Цинссера. • МР № 28 -6/39 от 08. 12. 87 Серологические методы диагностики риккетсиозов • МР 1985 г Микрометод реакции угнетения связывания комплемента в диагностике Ку-лихорадки и др. • СП 3. 1. 7. 2811 -10 Профилактика коксиеллеза. • МР от 20. 03. 80 Этиология, эпидемиология, клиника , лечение, лабораторная диагностика и профилактика клещевого риккетсиоза • МУ 3. 1. 1755 -03 Организация эпидемиологического надзора за клещевым риккетсиозом.

Обнаружение возбудителя и получение его культуры для подтверждения этиологии болезни (до лечения АБ) • Лабораторные животные (морские свинки, белые крысы, хомячки) • Куриные эмбрионы • Клеточные культуры • Иммуногистологическое, иммуноцитохимическое изучение биоптатов из кожных высыпаний, первичного аффекта, лимфатических узлов и т. д. • Методика выявления специфическими моноклональными антителами риккетсий на эндотелиальных клетках, свободно циркулирующих в кровяном русле больного. • Ранее применялся метод ксенодиагностики (кормление платяных вшей на больном или инфицированной кровью больного через искусственную мембрану).

В случае , когда неясны эпидемиологическая и экологическая характеристики заболевания и имеет место вспышка болезни • Выделяют возбудитель из предполагаемых перенисчиков (клещи, вши), из возможного источника-резервуара возбудителя (грызунов, домашних животных)

Основной метод первичной идентификации возбудителя и дифференциальной диагностики • Сероиммунологический метод

Феномен Weil и Felix (агглютинация микроорганизмов из рода Proteus с сыворотками больных сыпным тифом). • РА с Proteus OX 19 (эпидемический сыпной тиф, КПЛ) • РА с Proteus Oxk (лихорадка цуцугамуши)

Реакция агглютинации Диагностикумы на основе специфических антигенов различной степени дисперсности. - Занимает мало времени - Выполняется в модификациях (в пробирках, на планшетах или предметных стеклах) - Выпускаются корпускулярные АГ для диагностики эпидемического и эндемического тифа, лихорадки Ку и окопной лихорадки

Реакция связывания комплемента - Применяется для обнаружения антител в сыворотке крови больных. Относится к сложным серологическим реакциям: АГ, АТ, комплемент, гемолитическая система (выявляющая результаты реакции).

Гемолиза нет – весь комплемент расходуется на специфическую связь комплекса антиген-антитело. Положительная реакция.

Лизис сенсибилизированных эритроцитов барана наступает только в случае присоединения к гемолитической системе комплемента. Отсутствие в сыворотке АТ , соответствующих АГ, комплемент остается свободным и может присоединиться к гемолитической системе.

Реакция связывания комплемента • Современные антигенные препараты для РСК содержат взвесь корпускул возбудителя и растворимые фракции соответствующих микроорганизмов (это обеспецивает высокую специфичность и четкость получаемых результатов) • РСК с растворимым АГ не обеспечивает дифференциацию болезней внутри группы сыпного тифа и группы КПЛ. Необходимо применение корпускулярных АГ.

Реакция непрямой гемагглютинации - метод выявления антигенов и антител, основанный на способности эритроцитов, на поверхности которых предварительно адсорбированы антигены или антитела, агглютинироваться в присутствии гомологичных сывороток или соответствующих антигенов. При обнаружении антигенов реакция обозначается обратной пассивной гемагглютинацией - РОПГА (reversed passive hemagglutination test), а при обнаружении антител пассивной гемагглютинацией - РПГА (passive hemagglutination test).

РНГА • В РФ широкое применение для диагностики сыпного тифа. • Существуют макро- микроварианты, пробирочная постановка, планшетная, латекс-агглютинация, с добавлением комплемента и т. д. • Реакция проста в исполнении и высокоспецифична

РНГА

Метод флуоресцирующих антител – наиболее распространенный и стандартный метод подтверждения риккетсиозов. • РНИФ – определение специфических АТ в непрямом МФА, проводится с применением корпускулярных АГ с введением в реакцию меченных флуорохромом иммуноглобулинов или Fab-фрагментов антивидовых сывороток по отношению к испытуемым. Результаты регистрируют путем исследования препаратов в люминесцентном микроскопе.

РНИФ – «золотой стандар» диагностики риккетсиозов, рекомендован ВОЗ

Иммуноферментный анализ (метод энзиммеченных антител - ELISA) – высокочувствительный метод • Идентификация возбудителя, его АГ, определения специфических АТ. • Регистрация результатов визуально или спектрофотометрически. • Возможность использования в качестве антигена как растворимых, так и корпускулярных фракций возбудителя.

МФА и ИФА дают возможность не только определять специфические АТ, но и анализировать состав иммуноглобулиновых фракций. • Положительные реакции определения антител у большинства больных возможно получить лишь на 2 й неделе болезни. Без лечения антибиотиками достигают максимума к 15 -30 дню с момента появления первых клинических симптомов!

В группе СТ, КПЛ и эрлихиозов существуют значительные перекрестные реакции, обусловленные общностью антигенных структур возбудителей внутри групп. • Ни одна из существующих используемых модификаций серологических реакций не обеспечивает четкие дифференцирующие ответы.

Особенности диагностики коксиеллеза. • Коксиелла Бернета имеет сложную антигенную структуру, связанную с фазовым состоянием возбудителя.

Необходимо применять АГ для диагностики коксиеллеза, полученные из возбудителя, находящегося в: • I фазе (АТ появляются с 3 -4 недели болезни, в период выздоровления снижаются и исчезают) • II фазе (первичная диагностика, АТ формируются в начале болезни, выявляются во все периоды заболевания) • I-П (переходной) фазе Вне зависимости от используемого серологического метода исследования сыворотки!

Окончательная расшифровка этиологической принадлежности возбудителя заболевания в группах риккетсиозов, бартонеллеза, эрлихиозов и коксиеллеза. • Техника моноклональных антител • Иммуноблоттинг • ПЦР с последующим секвенированием продукта

ПЦР • Широко используется для классификации микроорганизмов на основе выявления сходства и различий в геноме, в клинической практике - для идентификации возбудителя в различных субстратах от больного с очень высокой чувствительностью.

На сегодняшний день созданы наборы праймеров для идентификации всех представителей риккетсиозов, бартонеллеза, эрлихиозов и коксиеллеза. • На основе фрагментов гена цитрат синтазы, • Генов белков 17 к. Да, 120 к. Да и 190 к. Да • Гена 16 S r. RNA и др. Полученные ПЦР фрагменты нуклеиновых кислот подвергают дополнительному рестрикционному анализу (RFLP) и секвенированию для дифференцировки видов.

Спасибо за внимание!