Лабораторная диагностика редких болезней Захарова Е Ю Москва

Лабораторная диагностика редких болезней Захарова Е. Ю. Москва, 20 октября 2014

Что такое редкие болезни? Редкими (орфанными) заболеваниями являются заболевания, которые имеютраспространенность не более 10 случаев заболевания на 100 тысяч населения (Федеральный закон Российской Федерации от 21 ноября 2011 г. N 323 -ФЗ) Известно около 10000 редких заболеваний, многие из них скрываются под «маской» других болезней

Редкие болезни • Более чем 80% редких заболеванийнаследственные болезни • Для подтверждения большинства из них необходимы лабораторные методы диагностики: биохимические или молекулярно -генетические тесты • Для нескольких сотен заболеваний разработаны эффективные методы лечения • Большинство наследственных болезней, поддающихся лечению относятся к классу наследственных болезней обмена веществ

Подходы к лабораторной диагностике НБО Ген ДНК-диагностика Белок Энзимодиагностика и другие методы анализа белков Метаболиты Хроматографические или другие количественные методы

Что ждут врачи от лаборатории? • Подтверждение диагноза у больного • Выявление болезни на доклинической стадии • Прогноз течения и тяжести заболевания у больного • Контроль лечения

НЕ все лабораторные тесты одинаковы! • • Чувствительность Специфичность Стоимость Сложность выполнения

«Идеальный тест» • • Высокочувствительный Высокоспецифичный Простой Дешевый Быстрый Малоинвазивный Один тест = много заболеваний

8

Простые тесты с мочой Цианид-нитропруссидный тест -цистинурия, гомоцистинурия Тест с ДНФГ - лейциноз Тест на гомогентизиновую кислоту -алкаптонурия Тест на метилмалоновую кислоту -метилмалоновая ацидемия

Тандемная масс спектрометриясовременная технология диагностики НБО Позволяет анализировать большое число метаболитов, а значит выявлять большое число НБО Время анализа одного образцанесколько минут Требуется небольшое количество биологического материала (пятно высушенной крови)

Тандемная-масс спектрометрия Аминоацидопатии Лейциноз (1: 185 000) ФКУ (1: 8000) Тирозинемия тип 1 (1: 100 000) Некетотическая Гиперглицинемия (1: 55 000) Цитрулинемия (1: 250 0000) Органические ацидурии Глутаровая ацидурия тип 1 (1: 30 000) Пропионовая ацидемия (1: 50 000) Метилмалоновая ацидурия (1: 48 000) Изовалериановая ацидурия (1: 50 000) Дефекты β-окисления Недостаточность SCAD Недостаточность MCAD Недостаточность VLCAD Недостаточность LCAHD Недостаточность CPT 1 Недостаточность CPT 2 Другие дефекты β-окисления

Все ли так просто?

Трудности интепретации Интерпретация результатов МС/МС анализа не всегда однозначна Показатели могут иметь пограничные значения Один метаболит – несколько заболеваний Вторичные изменения

Недостаточность длинноцепочечной 3 -гидроксиацил-Ко. А дегидрогеназы Острая неонатальная форма Хроническая форма ДЦ АК 3 -ОН ДЦ АК ДЦАК 3 -ОН ДЦ АК C 12 ↑↑↑ C 14: 1 ↑↑↑ C 16: 1 ↑↑↑ С 16 ОН ↑↑↑ С 18: 1 ОН ↑↑↑ C 12 N C 14: 1 N C 16: 1 N С 16 ОН ↑ или N С 18 ОН ↑или N С 18: 1 ОН ↑или N ОДЦАД или ДЦГАД ? ? ? У 50% ПАЦИЕНТОВ С 0 ↓ ↓ ↓

Диагностические соотношения Параметр Недостаточность длинноцепочечной 3 -гидрокси-ацил-Ко. А дегидрогеназы (n=15) Ср 0, 771 (0, 483 -1, 06) (0, 316 -2, 29) Ср 0, 006 (0, 004 -0, 008) (0 -0, 167) С 18: 1 ОН Ср 0, 642 (0, 416 -0, 869) (0, 202 -2, 03) Ср 0, 008 (0, 005 -0, 010) (0 -0, 179) С 16 ОН Ср 0, 751 (0, 447 -1, 054) (0 -1, 97) Ср 0, 009 (0, 007 -0, 012) (0 -0, 222) С 16 ОН/С 16 Ср 0, 414 (0, 312 -0, 515) (0 -0, 923) Ср 0, 009 (0, 006 -0, 012) (0 -0, 4) (С 18 ОН+С 18: 1 ОН+ С 16 ОН)/С 0 Ср 0, 131 (0, 088 -0, 173) (0, 035 -0, 318) Ср 0, 001 (0 -0, 001) (0 -0, 13) С 18 ОН Контроль (n=1580)

Разработка тестов «второй очереди»

Метилмалонил & сукцинилкарнитин С 3 С 4 DC SC MMC SUCLA 2 0, 60 2, 44 1, 64 0, 39 SUCLG 1 1, 43 2, 73 1, 46 0, 25 MMA 14, 93 4, 89 0, 58 4, 25 0, 2 -6, 8 0, 1 -1, 5 0, 1 -0, 7 0, 1 -0, 52 Clinica Chimica Acta null 2013

Оротовая кислота Патологический метаболит Патология м. М/М креатинина Норма м. М/М креатинина Оротовая кислота 1090 (OTC) 1 -6 (n=47)

Новый метод LC-MS/MS для анализа дерматан сульфата и гепаран сульфата Christiane Auray-Blais a, et al «Efficient analysis of urinary glycosaminoglycans by LC-MS/MS in mucopolysaccharidoses type I, II and VI» . Molecular Genetics and Metabolism 102 (2011) 49– 56

Новые биохимические маркеры болезни НПС Массовый скрининг новорожденных Селективный скрининг Контроль лечения

Врач + лаборатория = успех диагностики!

Пример из жизни • Пациент М. 1 г 6 мес • Повышение • Жалобы на концентрации нарушение орнитина в крови переносимости за внимание! Спасибо • Повышение белка с 6 мес, оротовой кислоты в ЗПМР, нарушения вскармливания, моче гепатит неясной (300 мк. М/Мкреат ) этиологии 24

Продолжение • Проведен анализ • Установлен диагноз - недостаточность гена ОТС , найдена ОТС, Х-сцепленный замена с. 809 А-G, тип наследования которая была интерпретирована • На сроке 9 недельсемья обратилась в как патогенная. Все ли сходится? лабораторию

Финал истории • Проведен анализ гена • Проведена SLC 25 A 15, пренатальная c. 415_416 del. GA в диагностика – гомозиготном состоянии. плод не поражен! • Установлен диагноз. ННН синдром, Хсцепленный рецессивный тип наследования

методы исследования белков

ВРОЖДЕННЫЕ НАРУШЕНИЯ ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЯ

ИЗОЭЛЕКТРОФОКУСИРОВАНИЕ ТРАНСФЕРРИНОВ КРОВИ ПРИ НАРУШЕНИЯХ ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЯ A B C D E F АНОД G 6 5 4 От 0 до 6 – от асиало- до гескасиалотрансферрина. 3 2 1 0 КАТОД A – отрицательный контроль, G – положительный контроль (генетически подтвержденный диагноз CDG-Ia), B – нарушения гликозилирования I типа, C – F – нормальное гликозилирование. Генетический диагноз пациентов B и G – нарушения гликозилирования Ia типа (фермент – фосфоманномутаза 2, ген – PMM 2, 16 р13. 3 -13. 2). Генотип B: Генотип G: PMM 2 [c. 303 C>G] + [c. 303 C>G] ([p. 101 N>K] + [p. 101 N>K]) PMM 2 [c. 470 T>C] + [c. 548 T>C] ([p. 157 F>S] + [p. 183 F>S])

Молекулярно-генетическая диагностика наследственных болезней • 3. 200. 000 пн в геноме человека • >200. 000 кодирующих экзонов (>30. 000 пн) • При этом многие наследственные заболевания связаны с заменой одной единственной буквы в геноме!

MLPA • Созданы две диагностические панели для выявления наиболее частых точковых мутаций мт. ДНК методом MLPA-анализа. Первая панель включает мутации: G 14459 A, A 8344 G, T 13094 C, A 3243 G, G 13513 A, T 8993 C/G; • вторая панель: G 8363 A, T 14484 C, G 3460 A, G 11778 A, G 3697 A. • Данный методический поход применяют в качестве первого этапа диагностики МБ • И для анализа частоты вышеуказанных мутаций в популяции.

Зебра среди зебр…

Экзомное секвенирование

Рост числа лабораторий и генетических тестов

Сеть лабораторий