Лабораторна робота рестрикція фага лямбда за

Лабораторна робота , , рестрикція фага лямбда за допомогою рестриктаз Sma. I, Bam. HI, Eco. RI і АраІ”

Система метилювання-рестрикції ü ü ü ü Поширена в прокаріот; Рідко зустрічається в еукаріот; Складається з метилази і відповідної рестриктази; Кожен ВИД І ШТАМ прокаріот містить свою унікальну систему МР; Захищає прокаріотичну клітину від чужорідної ДНК (бактеріофаги); Є незамінною і широко використовується в in vitro маніпуляціях з ДНК; Бактеріофаги відрізняються за здатністю інфікувати і розмножуватись в клітинах різних штамів бактерій; Фаги, які розмножувались в клітинах одного штаму бактерій обмежені в здатності інфікувати інші штами. © 2012 Pearson Education, Inc.

Система метилювання-рестрикції (МРсистема) мікроорганізмів (а) – чужорідна ДНК в клітині E. coli деградуэться рестриктазами без відповідного метилювання

Система метилювання-рестрикції (МРсистема) мікроорганізмів (b) – ДНК E. сoli метильована за сайтом Eco. RI

Система метилювання-рестрикції (МРсистема) мікроорганізмів (b) – ДНК E. coli не деградуэться рестриктазами

Рестриктази I-го типу Являють собою складний білок, який складається з декількох поліпептидних субодиниць; Комплекс містить: Дві R (restriction, рестрикція) субодиниці; Дві M (methylation, метилювання) субодиниці; Одну S (specificity, специфічність) субодиницю; Сайт гідролізу ДНК міститься на довільній відстані від сайту розпізнавання; Приклад – Eco. K з E. coli: сайт розпізнавання несиметричний

Рестриктази IІІ-го типу Являють собою складний білок, який складається з декількох поліпептидних субодиниць; Сайти розпізнавання на ДНК розташовані симетрично; Сайт гідролізу ДНК міститься на ТОЧНО ДЕТЕРМІНОВАНІЙ відстані від сайту розпізнавання; Приклад – Eco. РІ з E. coli: сайт розпізнавання несиметричний AGACC (27/25)

Рестриктази IV-го типу Досліджені недостатньо; Складаються з одного поліпептидного ланцюга, який володіє і метилазною і рестриктазною активністю; Сайт гідролізу ДНК міститься на відстані до 30 нуклеотидів від сайту розпізнавання; Гідролізуюють тільки модифіковані (метильовані, гідроксиметильовані, глікозил-гідроксиметильовані) послідовності; Приклад – Eco 571 з E. coli: сайт розпізнавання несиметричний CTGAAG (16/14)

Рестриктази IІ-го типу Широко використовуються в бтх: - Розпізнають паліндромні і непаліндромні послідовності; - Сайт гідролізу розміщений в сайті розпізнавання і чітко детермінований (або розміщений на чітко детермінованій відстані); - При гідролізі ДНК утворюють , , тупі”, або , , липкі” кінці. Розпізнають паліндромні послідовності з 4 -8 нуклеотидів; Потребують Mg 2+ в якості кофактора; В РМ-системі метилаза і рестриктаза є незалежними окремими білками; - Не потребують АТФ; - При гідролізі ДНК на 5’-кінці залишається залишок фосфорної кислоти.

Рестриктази IІ-го типу підкласу ІІР - Більше половини усіх рестриктаз ІІ типу відносяться до підкласу ІІР: розпізнають тетра- гекса- і октануклеотидні паліндроми: - Або для Hae. I i Hae. II, відповідно, сайти, в яких можливі альтернативні симетричні варіанти: (де Pu – пуриновий нуклеотид, Py – піримідиновий, N –будь-який)

Рестриктази IІ-го типу підкласів ІІW і IIN - ІІW - pозпізнають пента- гептануклеотидні паліндроми з різними варіантами центрального і фланкуючих нуклеотидів: - ІІN – pозпізнають паліндроми, які можуть перериватись декількома довільними нуклеотидами: Sfi. I - сайти (де Pu – пуриновий нуклеотид, Py – піримідиновий, N –будь-який)

Рестриктази IІ-го типу підкласів ІІS і IIT - ІІS – pозпізнають НЕПАЛІНДРОМНІ послідовності, які складаються з 4 -6 і більшої кількості нуклеотидів і гідролізують ДНК на чітко детермінованій відстані від сайту розпізнавання (1 -20 нуклеотидів): Mnl. I - ІІT – pозпізнають НЕПАЛІНДРОМНІ послідовності, які складаються з 4 -6 і більшої кількості нуклеотидів і гідролізують ДНК в цих сайтах: Sgr. AI (де Pu – пуриновий нуклеотид, Py – піримідиновий, N –будь-який)

Утворення , , тупих” і , , липких” кінців. Гідроліз на певній відстані від сайту розпізнавання. - 5’-липкі кінці: - 3’-липкі кінці: - Hga. I: GACGC (5/10): (де Pu – пуриновий нуклеотид, Py – піримідиновий, N –будь-який)

Ізошизомери і гетерошизомери Ø ІЗОМЕРИ – рестриктази різного походження, які розпізнають однакові сайти на ДНК; Ø ІЗОШИЗОМЕРИ - рестриктази різного походження, які розпізнають однакові сайти і гідролізують ДНК за однаковими положеннями;

Ізошизомери і гетерошизомери Ø ГЕТЕРОШИЗОМЕРИ - рестриктази різного походження, які розпізнають однакові сайти, але гідролізують ДНК за різними положеннями;

Утворення нових сайтів рестрикції

Вплив Dam- і Dcm-метилювання на рестрикцію - Dam і Dcm – дві метилази E. сoli, які не зв’язані з РМ-системами; -Метилювання за участю Dam-метилази: -Метилювання за участю Dсm-метилази:

Вплив Dam- і Dcm-метилювання на рестрикцію

Склад суміші для проведення рестрикції № 1 № 2 № 3 № 4 Н 2 О 14 мкл 12 мкл Розчин фага λ (0, 3 мкг/мкл) 10 -ти кратний буферний розчин (Кінцева кратність) 3 мкл 10× Tango – 2 мкл (1×Tango) 10× Green – 2 мкл (1×Green) 10× Tango – 4 мкл (2×Tango) Розмішати і внести: Розчин рестриктази Ара. I - Sma. I - Bam. HI Eco. RI 1 мкл - 1 мкл Кінцевий об’єм суміші - 20 мкл

Склад суміші для проведення рестрикції і умови проведення реакції v. В окремих випадках до складу суміші для рестрикції може входити альбумін; v Реакцію, для більшості конвенційних рестриктаз, проводять протягом 1 години при 37ºС. v Для окремої серії ферментів класу Fast. Digest® (Fermentas) рестрикція 1 мкг ДНК може тривати від 5 до 15 хв; v. Реакцію зупиняють прогріванням суміші при 65 90ºС протягом декількох хвилин і/або заморожуванням.

Bam. HI Green 10 m. M трис-HCl (p. H 8, 0) 10 m. M трис-HCl (p. H 7, 5) 100 m. M КCl 5 m. M Mg. Cl 2 50 m. M Na. Cl 10 m. M Mg. Cl 2 0, 02% тритон Х-100 1 m. M меркаптоетанол 0, 1 мг/мл БСА

Вплив метилювання ДНК на рестрикцію за допомогою Bam. HI ü на рестрикцію за допомогою рестриктази Вam. HI не впливають такі типи метилювання, як: - Dam; - Dcm; - Cp. G; - Eco. KI; - Eco. BI.

Eco. RI 2 x Tango Eco. RI 66 m. M трис-ацетат (p. H 7, 9) 50 m. M трис-HCl (p. H 7, 5) 66 m. M калій ацетат 100 m. M Na. Cl 20 m. M магній ацетат 10 m. M Mg. Cl 2 0, 2 мг/мл БСА 0, 02% тритон Х-100 0, 1 мг/мл БСА

Ара. I Blue 10 m. M трис-HCl (p. H 7, 4) 50 m. M Na. Cl 1 m. M ДТТ 0, 2 мг/мл БСА 1 Mm ЕДТА

Sma. I Tango 33 m. M трис-ацетат (p. H 7, 9) 33 m. M калій ацетат 10 m. M магній ацетат 0, 1 мг/мл БСА

Як відрізнити star-активність від неповної рестрикції Рестрикція фага лямбда за допомогою Eco. RI. Доріжки: 1 - Без рестрикції 2 – Інкубація 1 година з 0, 15 одиницею активності 3 - Інкубація 1 година з 0, 4 одиницею активності 4 - Інкубація 1 година з 1 одиницею активності 5 - Інкубація 1 година з 40 одиницями активності 6 - Інкубація 1 година з 70 одиницями активності

Причини star-активності рестриктаз: Ø тривала інкубація; Ø висока концентрація фермента в суміші; Ø висока концентрація гліцеролу в суміші; Ø присутність органічних розчинників (етанол, ДМСО, диметилформамід); Ø низьке значення іонної сили буферного розчину; Ø неоптимальні значення р. Н суміші; Ø заміна іонів Mg 2+ на іони Mn 2+, або Co 2+;

Причини star-активності. , , Хибна” star-активність. Що виглядає як star-активність ? ü окремі рестриктази залишаються зв’язаними з ДНК після внесення розриву. Це може спричинити порушення в мобільності продуктів рестрикції при аналізі в агарозному гелі. Для того, щоб усунути цей ефект, використовують спеціальні буферні розчини для приготування зразків – вони містять ДСН (після внесення буферного розчину проби інкубують протягом 10 хвилин при 65ºС); ü високою здатністю зв’язуватись з продуктами рестрикції володіють окремі рестриктази категорії Fast. Digest®, а також окремі конвенційні рестриктази (Eco 571, Eco. RII, Tau. I, Mbo. II та інші)

Eco. RI Причини star-активності рестриктази Eco. RI: Ø висока концентрація фермента в суміші; Ø низьке значення іонної сили буферного розчину; Ø значення р. Н суміші вищі за 8, 0; Ø заміна іонів Mg 2+ на іони Mn 2+; На рестрикцію за допомогою рестриктази Eco. RI впливає метилювання в сайтах Cp. G.

Причини star-активності і starактивність рестриктази Bam. HI ü за умов низької іонної сили, концентрації гліцеролу ˃5% і при р. Н˃8, 0 реакційної суміші рестриктаза Вam. HI, окрім основної послідовності GGАТCC, може розпізнавати і розрізати ДНК за такими послідовностями: NGАТCC, ГPu. АТCC та GGNТCC.

Розвиток інфекції фага лямбда за двома незалежними взаємовиключними шляхами

Інтеграція бактеріофага лямбда шляхом рекомбінації в бактеріальну хромосому

Вихід бактеріофага лямбда шляхом , , незаконної рекомбінації” з бактеріальної хромосоми.

Карта геному фага лямбда

Після потрапляння фага в клітину починають транскрибуватись передранні гени

Експресія затримано ранніх генів - за умов антитермінації білком р. N (продукт передранніх генів)

На термінальному етапі літичної інфекції транскрибуються пізні гени за умов антитерміна ції білком Q (продукт затримано ранніх генів)

Деякі стратегії регуляції синтезу матричних РНК на рівні ініціації транскрипції в прокаріот і бактеріофагів

Регуляція на рівні термінації транскрипції

Антитермінаторні ділянки в промоторнооператорних ділянках PL/OL i PR/OR фага лямбда

Молекулярний механізм і схема забезпечення шляхів лізогенії і літичної інфекції

Молекулярний механізм взаємодії білків сІ і cro

Вектор Zap. II на основі фага лямбда для отримання рекомбінантних білків

Інтеграція гена-вставки в ділянку гена lac. Z, який знаходиться в MCS-сайті вектора Zap. II

Отримання химерного білка з вставки в рамці зчитування lac. Z за допомогою вектора Zap. II