Лабораторна діагностика метаболічних захворювань в медико-генетичній практиці Директор

Лабораторна діагностика метаболічних захворювань в медико-генетичній практиці Директор - чл. -кор АМНУ, професор О. Я. Гречанiна Харківський спеціалізований медико-генетичний центр

• При вроджених порушеннях метаболізму накопичуються субстрати, які утворюються за допомогою альтернативних метаболічних шляхів • Концентрація фізіологічних метаболітів зазвичай ретельно контролюються • Нормальний рівень хімічних сполук залежить від метаболічного стану під час збору зразків • Адекватна інтерпретація результатів вимагає знання клінічних проблем у пацієнта і достатнього розуміння метаболічних змін для оцінки біохімічних порушень

Особливості роботи метаболічної лабораторії • При вроджених порушеннях метаболізму лабораторні дослідження дуже часто є складними і сполучені з технічними проблемами. • Для дотримання припустимих стандартів, лабораторії, що виконують дослідження повинні обробляти досить великий обсяг проб і брати участь у розробці схем оцінки якості.

Зв’язок етапів лабораторного дослідження Преаналітичний етап Діагностична значимість і специфічність показників, що призначаються Постаналітичний етап Аналітичний етап

Преаналітичний етап: • Сомато-генетичне дослідження з синдромологічним і клінікогенеалогічним аналізом • підготовка пацієнта • взяття зразка біологічного матеріалу • Зберігання та транспортування зразків

Клiнiчi особливості хворих з підозрою на вроджене порушення метаболізму Анамнез Кровно споріднений шлюб Пологи (тижнів) Клiнiка гостре метаболічне порушення рецидивуюче блювання клiнiчна картина, як при сепсисі / менiнгiтi без лабораторних даних тахiкардiя/аритмiя офтальмологiчнi порушення затримка розвитку макроцефалія атаксія • вади розвитку • С-м раптової дитячої смерті в родоводі • Епiлепсiя • Нефропатiя/тубулопатiя • Порушення з боку серцево-судиної системи • Інше екстрапiрамiднi порушення аутизм • летаргія, кома різкий запах мало п’є м’язова гіпотонія сип затримка зросту, ваги мiкроцефалiя судоми синдактилія 2 -3 пальців порушення слуху • нирковокам'яна хвороба • Інше • Рейе подібний синдром • гепатопатiя кардiомiопатiя катаракта втрата набутих навичок • лейкодiстрофiя

Лабораторні особливості хворих з підозрою на вроджене порушення метаболізму Лабораторні метаболічний дані Пiдвишений аніонний проміжок ацидоз NH 3___мкмоль/л ) Мiоглобiнурiя Сечова кислота / Знижений рівень холестерину кетоацидоз Гiпоглiкемiя___ ммоль/л пiдвишення рівня трансамiназ Пiдвишений рiвень креатинкiнази ) лактат___ммоль/л Анемiя/тромбоцито/ кретинiн / лейкопенія Постпрандiальнi кетонові тіла Алкалоз Інше: Перманентна кетонурiя Попередній діагноз (при наявності контролю за перебігом хвороби, необхідно вказати на проведення спецiальнх аналiзiв)

Методи, що використовуються для діагностики метаболічних захворювань Уринолізіс – якісні та кількісні реакції Матеріал для дослідження - ранішня сеча Тонкошарова хроматографія (ТШХ). Матеріал - кров, сеча добова. Класичні біохімічні показники та ферменти (глюкоза, Са, Р, ЛДГ, КК, тощо) Кількісний аналіз амінокислот з використанням HPLC, Waters. Масові скринінг - програми новонароджених: діагностика ФКУ та природженого гіпотиреозу Матеріал - сухі плями крові Перспективні дослідження – кількісний аналіз органічних та жирних кислот з використанням тандемної мас-спектрометрії

ПРОСТІ АНАЛІЗИ СЕЧІ НА МЕТАБОЛІЧНІ ПОРУШЕННЯ • можуть давати перші важливі діагностичні критерії для постановки діагнозу метаболічних порушень. • В якості першого етапу діагностики метаболічних захворювань проводять експрес тести сечі, що дозволяють швидко виявити ряд речовин. • Деякі з якісних реакцій є неспецифічними, але позитивний тест може спрямувати на подальший пошук.

Прості метаболічні тести сечі Важливим є оцінка запаху та кольору сечі. Якщо виключена харчова (наприклад, буряк) або лікарська (феназопіридин) інтерференція, забарвлення сечі може бути обумовлене: · червоне присутністю крові або порфіринів; · коричневе - гемоглобіном та міоглобіном; · зеленкувате – білірубіном; · чорне (при стоянні сечі або після підлужування) гомогентизиновою кислотою (алкаптонурія)

Прості метаболічні тести сечі Відмічають будь-який незвичайний запах, який може бути викликаний метаболічними захворюваннями: ·Кленового сиропу або каррі-подібний - при хворобі кленового сиропу (цей запах важко виявити у більш дорослих пацієнтів, сеча яких не контактує з повітрям). ·Спітнілих ніг – обумовлений ізовалеріановою кислотою та ізовалерілгліціном, які єкскретуються у пацієнтів із дефіцитом ізовалеріл-Со. А дегідрогенази; ·Плісняви або затхлий - при фенілкетонурії; ·Котячий дефект β-метілкротоніл Со. А карбоксилази; ·Риби - при 3 -метіламінурії.

• Тест на кетонові тіла - позитивний при порушенні метаболізму органічних кислот і мітохондріальних хворобах. • Відсутність або низький рівень кетонових тіл у відповідь на гіпоглікемію - порушення окислення жирних кислот або глікогеноз 1 типу • ціанід-нітропрусидний тест – при гомоцистінурії і цистінурії. • Реакція с ДНФГ на -кетокислоти позитивна при хворобі кленового сиропу. • Нітрозонафтоловий тест дозволяє виявити порушення метаболізму тирозину

Класичні біохімічні показники, як маркер метаболічних порушень

Лабораторні дослідження при підозрі на СПО

Вимоги до методів обстеження при проведенні масового скринiнгу новонароджених: Виражена діагностична значимість; надійність; доступність; економічність

ЭТАПИ СКРИНIНГ-ПРОГРАМ Перший етап виявлення дітей з Другий етап підтверджуюча первинним діагностика та позитивним iдентифiкацiя результатом патологii

ЦIЛI СКРИНIНГ ПРОГРАМ Основна встановлення діагнозу якомога раніше, введення дієтичної або замісної терапії, що попередить розвиток розумової вiдсталостi Первина iдентифiкацiя новонародженого з метаболічним дефектом

КРИТЕРII ДЛЯ ПРОВЕДЕННЯ МАСОВОГО СКРИНIНГУ Висока частота захворюваності в популяції; тяжкість клінічних проявів, що призводять до iнвалідизацiї; наявність ефективних методів лікування; наявність економічно вигідних i технічно доступних програм

ЕФЕКТИВНА СКРИНУЮЧА ПРОГРАМА Освіта та навчання населення, лiкарів, медичного персоналу; наявність централізованої лабораторії з ефективною підтверджуючою діагностикою; організація i постійне проведення постскринінгового етапу

ФКУ та ПГ відповідає усім параметрам щодо природженого захворювання, яке підлягає масовому скринінгу: Øмає точний біохімічний маркер і клінічні симптоми захворювання Ø наявні безпечні та достовірні скринуючі тести Ø має достатньо високу частоту на Україні Ø існує ефективне раннє лікування, яке необхідне для профілактики тяжких ускладнень здоров я у хворих дітей.

ØСкринінг на ФКУ та ПГ дозволяє діагностувати захворювання в перші тижні життя дитини ØНаявність ефективних спецiалiзованого харчування або лікарських форм, необхідних для терапії дозволяють проводити лікування у максимально фізіологічному режимі та оптимальними дозами. ØУ регіонах, де сумісна робота генетиків педіатрів, невропатологiв та ендокринологів чітко скоординована, результати від проведення скринінгу значно вищі.

Терміни забору крові. Ø Кров повинно брати на 3 -5 день після народження (не раніше!), шляхом через шкірної пункції Ø У зв'язку з тим, що в даний час практикується достатньо раннє виписування новонароджених з пологового будинку, виникає варіант раннього взяття крові (на 1 -2 день життя дитини). Це неприпустимо! Ø У випадках взяття крові на 1 -2 день життя дитини можливі "помилково позитивні” або "помилково негативнi” варіанти відповідей, оскільки в нормі в перші дні життя рівень ТТГ достатньо високий, а ФА може не накопичитися в достатнйій кількості.

Важливим етапом скринінг - програм є збір зразків крові на спеціальні бланки хроматографічного паперу

Недостатня кількість матеріалу (За матеріалами Центру по контролю та попередженню захворювань (CDC, США: Joe Orsini, Ph. D Ken Pass, Ph. D) ·Оцінені одиничні зразки дефектної/правильно зібраної пари сухих плям крові (СПК) у пацієнтів ·Виконане дослідження пари із зразків нормальних і дефектних плям ·Проведене визначення рівня TSH и ФА в СПК ·Проаналізовані данні за допомогою Excel (середнє, std. відхилення, тощо) ·Проведене порівняння даних з парами нормальних зразків • Примітка: на зворотній стороні бланку всі зразки виглядають задовільно. Правильний зразок Дефектний зразок

Статистичні результати оцінки помилок Висока негативна погрiшнiсть

Недостатня кількість матеріалу. Прийняття рішення

Вплив на прийняття діагностичного рішення ЛН – хибно негативний ЛП – хибно позитивний

Історія розвитку скринінгу на ФКУ у Восточній Україні ~скринінг на ФКУ в нашому регіоні було засновано в 1986. Проводилось визначення рівня ФА в сухих плямах крові. ~З 1986 по 1991 ми використовували метод Гатрі (бактеріальне інгібірування) та хроматографічний папір FN 8 або 11 ~З 1991 – флюорометричний метод, папір S&S 903. ~Зразки всіх новонароджених з Харківської, Полтавської, Чернігівської та Сумської областей надходять до централізованої лабораторії (ХСМГЦ обстежує біля 55 -60 новонароджених щорічно).

Результати скринінгу на ФКУ • За період дії скринінгу на ФКУ (20 років) було обстежено 981910 новонароджених • ФКУ було діагностовано у 137 дітей. Загальна частота ФКУ скала 1 на 7167 новонароджених

Карта України та регіони, якi надсилають зразки для обстеження новонароджених до ХСМГЦ

Пілотний скринiнг на природжений гiпотиреоз (ПГ) проводився в Харкiвськiй областi в 1990 -1992 рр та був поновлений 2001. • Ми визначаємо рівень тиреотропного гормону (TSH) в сухих плямах крові на 3 -5 день життя дитини; • З 1991 по 2005 рр. Ми використовували тестсистеми Delfia та флюорометр Arcus 1230 (timeresolved fluoroimmunoassay) • З кінця 2005 рр по теперішній час - ІФА тестсистеми (Labsystems) та ІФА аналізатор • Критерій підозри на природжений гіпотиреоз рівень TSH в сухих плямах крові більше 20 m. U/l; • Рівень TSH більше 5 m. U/l є показником йододефіциту в популяції ( критерії ВООЗ)

Результати скринінгу на ПГ • За період дії скринінгу на ПГ було обстежено 120880 новонароджених • З 2001 року по жовтень 2005 року - 38233 дитини з використанням тест-систем “Дельфія” • 3 кінця 2005 по теперішній час – 38211 новонароджених з використанням тест-систем ”Labsystems” • 168 немовлят (0, 22%) потребували проведення другого етапу скринінгу (було виявлено рівень TSH більше 20 м. U/l) • ПГ було діагностовано у 14 дітей. • Загальна частота ПГ скала 1 на 5460 новонароджених • 25226 (33, 7%) новонароджених мали рівень TSH більше 5 m. U/l, що свідчить про помірний йододефіцит

Визначення рівня йододефіциту за частотою зразків крові з рівнем понад 5 мк. Од/мл, отриманих у новонароджених на 5 добу, є самим точним (ВООЗ) Рівень ТТГ в сухих плямах крові понад 5 мк. Од/мл: • у 3% - 19, 9% новонароджених свідчить м'який йододефіцит (ЙД) в популяції • у 20 -39, 9% - про помірний йододефіцит • більше 40% - високий рівень ЙД про ВООЗ, 1999

Процентильна таблиця рівню ТТГ (мк. Од/мл) в сухих плямах крові Критичний рівень 205 зразків, тест-системи Wallac 1973 зразки, тест-системи Labsystem

Гістограма 1205 зразків для рівню ТТГ (мк. Од/мл) в сухих плямах крові (Wallac) Критичний рівень

Гістограма 1973 зразків для рівню ТТГ (мк. Од/мл) в сухих плямах крові (Any Labsystems) Критичний рівень

Важливим для постійної дiї програми е наявність повної системи, яка гарантує правильний збір зразків, проведення лабораторного аналізу, пост скринiнговий етап та лікування.

ТОНКОШАРОВА ХРОМАТОГРАФIЯ

Для кількісного розрахунку та побудови градуїровочної залежності використовували стандартну суміш АК

Хроматограми сироватки крові в нормі i при ФКУ

• Обов'язковою умовою забезпечення якості лабораторного процесу е участь у програмах зовнішнього контролю якості (ЗКЯ). • ХСМГЦ приймає участь в системі ЗКЯ Великої Британії (UK NEQAS) та США (CDC) для масових скринiнг - програм • За період з 2003 р ми отримали 216 «слiпих” зразків в 36 лотах. Кожен лот мiстить 6 контрольних зразків (папiр S&S № 903, 1 раз на 2 місяці). • Сумарний BIAS (відхилення середнього значення для лабораторiї від цільового значення), для ФА за даними UK NEQAS склав -8 %.

Програма Національної системи зовнішнього контролю якості Великої Британії для масових скринiг програм

Ми вибрали позицію «замкнутого кола» , i проводимо в ХСМГЦ первинну i підтверджуючу діагностику, реабілітацію i диспансерне спостереження сімей, що мають дітей з метаболічними порушеннями i вважаемо таку модель організації скринiнг - програм та попередженню розвитку розумової відсталості у дітей найбільш ефективною для роботи медико-генетичних консультацій i регіональних центрів

Дякую за увагу