Лаборатория ДНК-диагностики МГНЦ РАМН Заведующий

Лаборатория ДНК-диагностики МГНЦ РАМН Заведующий - А. В. Поляков

ЗАБОЛЕВАНИЕ Приобретенное Инфекционные заболевания Мультифакториальное Гены предрасположенности + Факторы внешней среды Моногенное Наследственные заболевания с Аутосомно-доминантным Аутосомно-рецессивным Х-сцепленным типом наследования

ДНК-диагностика моногенных заболеваний Изучает непосредственную причину заболевания Наиболее адекватная и точная диагностика Возможна даже в тех случаях, когда неизвестен ген, ответственный за заболевание

ДНК-ДИАГНОСТИКА n ПОДТВЕРЖДАЮЩАЯ n ПРЕСИМПТОМАТИЧЕСКАЯ n ГЕТЕРОЗИГОТНОГО НОСИТЕЛЬСТВА n ПРЕНАТАЛЬНАЯ

ДНК-диагностика ПРЯМАЯ Определение мутации, являющейся непосредственной причиной заболевания КОСВЕННАЯ Определение хромосомы, несущей поврежденный ген, при семейном анализе

ПРЯМАЯ ДНК-ДИАГНОСТИКА + + 100%-ная точность возможна при сомнительном диагнозе возможна при полилокусном заболевании возможна беспробандная диагностика - необходимо знание структуры гена - информативна не для всех семей

Информативность прямой диагностики Заболевание Ген (локализация) Информативность диагностики Ахондроплазия FGFR 3 (4 p 16. 3) 99% Хорея Гентингтона IT-15 (4 p 16. 3) 99% НС тугоухость типа DFNB 1 GJB 2 (13 q 12. 11) 99% САМ SMN (5 q 13) 98% ШМТ 1 А типа РМР 22 (17 р11. 2 -р12) 97% Атаксия Фридрейха Х 25 (9 q 13 -q 21. 1) 93% Фенилкетонурия РАН (12 q 22 -q 24. 1) 80% Адреногенитальный синдром CYP 21 (6 p 21. 3) 78% Муковисцидоз CFTR (7 q 31. 2) 72% Миодистрофия Дюшенна/Беккера Дистрофин (Хр21. 2) 60%

Принцип косвенной ДНК-диагностики - q D 5 S 435 5 q 13 S c M N t D 5 S 629 D 5 S 557 МАР 1 В JK 53 Локализация генов SMNt и SMNc и некоторых сцепленных с ними полиморфных ДНК-маркеров

Принцип косвенной ДНК-диагностики 1 1 2 4 3 2 3 4 1 3

КОСВЕННАЯ ДНК-ДИАГНОСТИКА больные 2 1 D 1 S 252 D 1 S 2696 2 1 3 3 3 1 здоровые 1 3 2 3 4 2 1 2 3 3 1 1 2 2 1 3 3

- q КОСВЕННАЯ ДНК-ДИАГНОСТИКА + не требуется знание гена и спектра мутаций в нем + информативна практически для всех семей абсолютная уверенность в клиническом диагнозе - точность 95 -99% - обязательно наличие одного локуса заболевания - обязательно проведение семейного анализа -

Косвенная ДНК-диагностика некоторых заболеваний, для которых прямая очень дорога и/или трудоемка n Гемофилия A, B - Хq 27 -28 n Синдром Луи-Бар – 11 q 23 n Синдром Миллера-Дикера – 17 p 13. 3 n Синдром Марфана – 15 q 21. 1 n Рецессивный поликистоз почек – 6 p 21. 1 – p 12 n Эктодермальная ангидратическая дисплазия - Xq 12 – q 13. 1 n Синдром Коффина-Лоури – Xp 22. 2 – p 22. 1

Моногенные болезни Болезни, обусловленные мутациями в одном гене n Заболевания, подчиняющиеся менделевским законам наследования n В OMIM описано около 5 тысяч фенотипов n Для 3318 из них известен молекулярный дефект n

Число генов с известными фенотипами n 2003 год ~ 1000 n 2005 год – 1700 n 2010 год – 3318

Типы ДНК-диагностики n Сокращение косвенных подходов n Резкое увеличение прямых методов

ДНК–диагностика 2003 год: Европа – 400 заболеваний* Россия – 50 заболеваний за 2003 год в России обследовано 1000 семей n 2010 год: Европа – 2000 заболеваний* Россия – 220 заболеваний за 2010 год в России обследовано ~ 6500 семей n * http: //www. gendia. net/tests. html

Типы мутаций n Нуклеотидные n Missense замены n Nonsense n Делеции n Frameshift n Инсерции n Мутации сайта сплайсинга n n n loss-offunction gain-offunction Изменение уровня экспрессии

Методы ДНК-диагностики: § § § § Анализ ПДАФ Анализ ПДРФ MLPA-анализ Флюоресцентная ПЦР Количественные MLPA и флюоресцентная ПЦР Секвенирование (ресеквенирование) Real-time ПЦР Анализ кривой плавления

ПДАФ анализ делеций гена дистрофина при МДД Хр21 -А -B -C -D -E -F Х 48 Ген дистрофина 3 51 43 45 44 53 4 -D -F -A -С -E -В 19 17 8 50 13 60 6 47 Pm 42 52 32

диагностика болезни Гентингтона Вертикальный электрофорез в полиакриламидном геле

Пример косвенной пренатальной ДНК-диагностики методом ПДАФанализа в семье, отягощенной по СМА. 140 п. о. 160 п. о. 128 п. о. 166 п. о. D 5 S 435 D 5 S 557 136 п. о. 166 п. о. 128 п. о. 166 п. о. 136 п. о. 166 п. о. 140 п. о. 160 п. о. 140 п. о. 136 п. о. 128 п. о. 166 п. о. 160 п. о.

Методы ДНК-диагностики: § § § § Анализ ПДАФ Анализ ПДРФ MLPA-анализ Флюоресцентная ПЦР Количественные MLPA и флюоресцентная ПЦР Секвенирование (ресеквенирование) Real-time ПЦР Анализ кривой плавления

Анализ наиболее частых мутаций в гене PAH методом ПДРФ А) одна пара праймеров и две эндонуклеазы рестрикции IVS 12+1 g>a Norm R 252 W R 261 Q R 408 W Norm Б) две пары праймеров и одна эндонуклеаза рестрикции 11 ex Norm IVS 10 -11 g>a 3 ex Norm I 65 T 1 2 3 P 281 L 7 ex Norm R 158 Q 5 ex Norm

Анализ трех частых мутаций в гене CFTR методом ПДРФ G 542 X W 1282 X/N N 1303 K Образец до рестрикции Норма

Методы ДНК-диагностики: § § § § Анализ ПДАФ Анализ ПДРФ MLPA-анализ Флюоресцентная ПЦР Количественные MLPA и флюоресцентная ПЦР Секвенирование (ресеквенирование) Real-time ПЦР Анализ кривой плавления

Анализ наиболее частых мутаций в гене PAH методом MLPA

Анализ пяти частых мутаций в гене CFTR методом MLPA

MLPA – мультиплексная амплификация лигированных олигонуклеотидов 1. Аллельспецифическое лигирование Проба 3 Проба 1 C А Т А Проба 3 С G Проба 2 ДНК ДНК

MLPA – мультиплексная амплификация лигированных олигонуклеотидов 2. Амплификация с универсальных праймеров

Методы ДНК-диагностики: § § § § Анализ ПДАФ Анализ ПДРФ MLPA-анализ Флюоресцентная ПЦР Количественные MLPA и флюоресцентная ПЦР Секвенирование (ресеквенирование) Real-time ПЦР Анализ кривой плавления

MLPA: поиск частых мутаций при ФКУ

MLPA. Количественный анализ экзонов гена дистрофина Гомозиготная делеция шести экзонов гена DMD 1 5 4 3 2 6 Гетерозиготная делеция экзонов 1 -6 гена DMD 2 6 1 5 4 3 Здоровый контроль 5 1 4 3 Здоровый контроль 2 6 5 1 4 3 2 6

Фрагментный анализ: проблема гомозиготности при диагностике болезни Гентингтона 66 повторов!!! гомозигота? HD 663. 1

Фрагментный анализ: диагностика миотонической дистрофии (МД 1) Норма

Фрагментный анализ: определение числа повторов в гене AR

Методы ДНК-диагностики: § § § § Анализ ПДАФ Анализ ПДРФ MLPA-анализ Флюоресцентная ПЦР Количественные MLPA и флюоресцентная ПЦР Секвенирование (ресеквенирование) Real-time ПЦР Анализ кривой плавления

Диагностика синдрома Дауна методом QF-PCR Отец Мать Ребенок 47, XY (+21)

Диагностика синдрома Дауна методом QF-PCR

Пример трисомии по хромосоме 21

Пример моносомии по Х-хромосоме (синдром Шерешевского-Тернера)

48, XYY+13

X-X транслокация (система Ан. Пол 24)

Фрагментарный анализ продукта реакции MLPA на приборе ABI Prism 3130 (“Applied Biosystems”) паттерн сигналов соответствует последовательнос тям генов TBP, B 2 M, SMNt (экзоны 7, 8), SMNc (экзоны 7, 8), SMN(t+c) (экзоны 1, 6), NAIP (экзон 5, два фрагмента), GTF 2 H 2 (экзон 4), RAD 17

Результаты обработки числовых параметров фрагментарного анализа продукта реакции MLPA с помощью программы Coffalyser V 8 Название фрагмента № 1, 2 – норма № 3 - делеция SMNt, 4 копии SMNc № 4 - делеция SMNt, 2 копии SMNc, делеция NAIP № 5 - делеция SMNt, 3 копии SMNc № 6 - делеция SMNt, 2 копии SMNc B 2 M GTF RAD 17 USP 3 SMNc ex 7 SMNt ex 7 NAIP ex 5(2) SIRT 3 SMN ex 6 NAIP ex 5(1) TBP SMNc ex 8 SMNt ex 8 SMN ex 1

Количественная MLPA: недержание пигмента (incontinentia pigmenti, Type II) женщины 12 3 4 мужчины 12 3 4 1 – ген NEMO 2 – псевдоген NEMO Ψ 3 – ген TBP (экзон 6) 4 – ген B 2 M (экзон 2)

Ген NEMO. Количественная MLPA

Методы ДНК-диагностики: § § § § Анализ ПДАФ Анализ ПДРФ MLPA-анализ Флюоресцентная ПЦР Количественные MLPA и флюоресцентная ПЦР Секвенирование (ресеквенирование) Real-time ПЦР Анализ кривой плавления

Диагностика атипичной ФКУ (ФКУ III). Поиск мутаций в гене PTS p. Arg 9 His/N p. Arg 9 His/ p. Thr 106 Me t p. Thr 106 Met/ N p. Arg 9 His/ p. Thr 106 Me t

Методы ДНК-диагностики: § § § § Анализ ПДАФ Анализ ПДРФ MLPA-анализ Флюоресцентная ПЦР Количественные MLPA и флюоресцентная ПЦР Секвенирование (ресеквенирование) Real-time ПЦР Анализ кривой плавления

Аллельспецифический анализ мутации С 598 Т гена VHL Mut/mut Mut/N N/N

Методы ДНК-диагностики: § § § § Анализ ПДАФ Анализ ПДРФ MLPA-анализ Флюоресцентная ПЦР Количественные MLPA и флюоресцентная ПЦР Секвенирование (ресеквенирование) Real-time ПЦР Анализ кривой плавления

HRMCA F 5 форма кривой плавления c. 1691 G>A c. 1691 G/ c. 1691 G c. 1691 A/ c. 1691 G

Методы прямой ДНКдиагностики: § § § Количественная флюоресцентная ПЦР Real-time ПЦР Анализ кривой плавления MLPA-анализ (количественная лигазная реакция) Ресеквенирование

Применение MLPA в ДНКдиагностике n Определение числа копий фрагмента (дозы гена) n Анализ однонуклеотидных замен (SNP)

MLPA. Количественный анализ экзонов гена дистрофина Гомозиготная делеция шести экзонов гена DMD 1 5 4 3 2 6 Гетерозиготная делеция экзонов 1 -6 гена DMD 2 6 1 5 4 3 Здоровый контроль 5 1 4 3 Здоровый контроль 2 6 5 1 4 3 2 6

Анализ однонуклеотидных замен (SNP) n Моногенные заболевания n Мультифакторные состояния

ДНК-диагностика “on-line” Клинический диагноз наследственного заболевания ГЕН ЗАБОЛЕВАНИЯ ИЗВЕСТЕН Разработка диагностического протокола для каждой конкретной семьи, даже с очень редким наследственным заболеванием

Форма помутнения хрусталика в семье с порошкообразной зонулярной катарактой

Сегрегационный анализ в семье с порошкообразной зонулярной катарактой больные ПЗК 2 1 D 1 S 252 D 1 S 2696 2 1 3 3 3 1 здоровые 1 3 2 3 4 2 1 2 3 3 1 3 2 1 3 3 3 1 1 2 Маркер LOD - баллы при значениях доли рекомбинаций 0. 00 0. 01 0. 05 0. 10 0. 20 0. 30 0. 40 0. 50 D 1 S 252 0. 60 0. 59 0. 54 0. 46 0. 32 0. 17 0. 05 0. 00 D 1 S 2696 0. 12 0. 13 0. 14 0. 15 0. 12 0. 07 0. 00

Анализ нуклеотидной последовательности гена Cx 50 у больного из семьи с порошкообразной зонулярной катарактой Замена T 741 G Ile 247 Met

Перспективы http: //www. humanvariomeproject. org/ http: //www. hgvs. org/

Перспективы n Ресеквенирование экзонов генов, вовлеченных в данную патологию n Ресеквенирование всех кодирующих последовательностей генома - экзома

Число наследственных заболеваний, для которых возможно проведение ДНК -диагностики в лаборатории ДНКдиагностики ГУ МГНЦ РАМН

Лаборатория ДНК-диагностики Наши координаты: 115478 Москва, Москворечье, 1 МГНЦ РАМН http: //www. dnalab. ru e-mail: info@dnalab. ru (495) 221 -90 -84 (499) 324 -05 -01

Лаборатория ДНК-диагностики МГНЦ РАМН Заведующий — А В