Скачать презентацию KVANTIFIKACE ZMĚN GENOVÉ EXPRESE Northern Скачать презентацию KVANTIFIKACE ZMĚN GENOVÉ EXPRESE Northern

ce7ee4d8148b0cdc1f3f467a29fd1e7b.ppt

  • Количество слайдов: 45

KVANTIFIKACE ZMĚN GENOVÉ EXPRESE KVANTIFIKACE ZMĚN GENOVÉ EXPRESE

 • Northern bloty pracné a zdlouhavé • Genové čipy nákladné; http: //www. molbio. • Northern bloty pracné a zdlouhavé • Genové čipy nákladné; http: //www. molbio. upol. cz/ • Semikvantitativní RT-PCR nepřesné • q. PCR metodiky real-time PCR vysoké dynamické rozpětí

problém: precizní kvantifikace m. RNA spektrofotometrické stanovení koncentrace RNA nemusí být dostatečné řešení: stanovení problém: precizní kvantifikace m. RNA spektrofotometrické stanovení koncentrace RNA nemusí být dostatečné řešení: stanovení koncentrace RNA pomocí fluorescenčního barviva RIBOgreen™ - 1000 x citlivější, nereaguje s nukleotidy a krátkými fragmenty. nebo relativní stanovení pomocí q. PCR

NORTHERN BLOT control expt cílový gen GOI referenční gen aktin, GAPDHetc korigovaný nárůst exprese NORTHERN BLOT control expt cílový gen GOI referenční gen aktin, GAPDHetc korigovaný nárůst exprese 10/2 = 5 =

aplikace REAL-TIME PCR 1) absolutní kvantifikace množství DNA ve vzorku k externímu standardu, detekce aplikace REAL-TIME PCR 1) absolutní kvantifikace množství DNA ve vzorku k externímu standardu, detekce virální či bakteriální DNA, forenzní chemie 2) koncová detekce SNP genotypizace, detekce mutací a polymorfismů 3) relativní kvantifikace srovnání úrovně exprese m. RNA nebo mikro. RNA mezi různými tkáněmi či biologickými podmínkami

princip měření vznikající fluorescence po každém cyklu PCR, stanovení křivek tání princip měření vznikající fluorescence po každém cyklu PCR, stanovení křivek tání

chemismus 1) interkalační barviva SYBRgreen interkalace barviva na dvoušroubovici vznikající (amplifikované) DNA precizní výběr chemismus 1) interkalační barviva SYBRgreen interkalace barviva na dvoušroubovici vznikající (amplifikované) DNA precizní výběr primerů – nesmí vytvářet dimery nutná kontrola amplifikovaného produktu na křivku denaturačních teplot

chemismus 2) hybridizační sondy (TAGman) uvolňování fluorescence po degradaci sondy nutná 5´-3´exonukleasová aktivita Taq chemismus 2) hybridizační sondy (TAGman) uvolňování fluorescence po degradaci sondy nutná 5´-3´exonukleasová aktivita Taq polymerasy fluorescenční značka: VIC, FAM (fluorescein) zhášeč: Tamra (Tetramethyl-6 -Carboxyrhodamine ) FRET = Förster/fluorescence resonance energy transfer

srovnání Tag. Man Sybr. Green specifita primery proba PCR podmínky primery PCR podmínky flexibilita srovnání Tag. Man Sybr. Green specifita primery proba PCR podmínky primery PCR podmínky flexibilita singleplex multiplex (max. 4) singleplex aplikace kvantifikace SNP detekce kvantifikace cena vysoká nízká

kontaminace • největší problém PCR • aerosol, pipety, staré amplikony • částečné řešení URACIL kontaminace • největší problém PCR • aerosol, pipety, staré amplikony • částečné řešení URACIL N-GLYKOSYLASA § § § štěpí ss a ds. DNA s inkorporovaným deoxyuracilem (d. UTP) termolabilní, 0% aktivita nad 55◦C nereaguje s templátem (d. TTP) d. UTP v q. PCR mixu místo d. TTP pracuje během nastavení PCR reakce

chyby v pipetování • • templát (c. DNA) premix (primery, proba, polymerasa, d. NTP, chyby v pipetování • • templát (c. DNA) premix (primery, proba, polymerasa, d. NTP, pufr, srovnávací fluorescenční barvivo) částečné řešení - ROX (Karboxy-X-Rhodamin) fluorescence se nemění během PCR cyklů a vzrůstající fluorescence v každé zkumavce vzorku je extrapolována na srovnávací DVOJÍ PIPETOVÁNÍ REAKČNÍ SMĚSI pracujeme s premixy 1) pufr, Mg 2+, d. NTP, ROX, Sybr. Green, Taq. Pol, primery 2) vzorek(c. DNA, genomická DNA)

lineární vynesení logaritmické vynesení lineární vynesení logaritmické vynesení

lineární ~20 do ~1500 lineární ~20 do ~1500

CT hodnoty treshold je třeba nastavit tak aby u každého vzorku procházel lineární části CT hodnoty treshold je třeba nastavit tak aby u každého vzorku procházel lineární části křivky CT počet cyklů při kterém fluorescence vzorku překročí threshold (prahovou hodnotu)

před každou kvantifikací je třeba vždy udělat standardní křivku templát: 10 x ředění buď před každou kvantifikací je třeba vždy udělat standardní křivku templát: 10 x ředění buď přímo c. DNA, nebo plasmid s naklonovaným genem, který stanovujeme CT koncentrace templátu

PARAMETRY STANDARDNÍ KŘIVKY • směrnice: ideální -3, 32 = 100% efektivita reakce • %EFF PARAMETRY STANDARDNÍ KŘIVKY • směrnice: ideální -3, 32 = 100% efektivita reakce • %EFF – kolik kopii templátu je zkopírováno v každém cyklu • R 2 korelační koeficient (tolerovat se dá ještě 0, 995) Eff=10(-1/slope) – 1

%EFF 100% 90% 80% 70% = 2. 00 x = 1. 90 x = %EFF 100% 90% 80% 70% = 2. 00 x = 1. 90 x = 1. 80 x = 1. 70 x relativní kvantifikace je možná pouze pokud sledovaný gen a referenční gen má srovnatelnou a vysokou efektivitu > 90% 3%

tolerance efektivity tolerance efektivity

Chemismus Sybr. Green Nutná kontrola výsledných amplikonů na teplotní křivky tání teplota Chemismus Sybr. Green Nutná kontrola výsledných amplikonů na teplotní křivky tání teplota

REFERENČNÍ GEN • musí mít stabilní expresi ve všech studovaných vzorcích • nejčastěji provozní REFERENČNÍ GEN • musí mít stabilní expresi ve všech studovaných vzorcích • nejčastěji provozní geny (house-keeping) • aktin, GAPDH, cyklofilin, 18 S RNA, EF 1

Taq. Man. Human Endogenous Control Plate CT Taq. Man. Human Endogenous Control Plate CT

 CT = 2 čtyřnásobný rozdíl v expresi změna v jednom cyklu při 100% CT = 2 čtyřnásobný rozdíl v expresi změna v jednom cyklu při 100% efektivitě je rovna dvounásobné změně ve výchozí koncentraci c. DNA 18 S ribosomální RNA • přepisována jinou RNA polymerasou než m. RNA • byly popsány výkyvy mezi množstvím r. RNA a m. RNA • nelze použít pokud se vychází z m. RNA

vyhodnocení kalibrátor sample 1 sample 2 izolace celkové RNA (m. RNA) přepis do c. vyhodnocení kalibrátor sample 1 sample 2 izolace celkové RNA (m. RNA) přepis do c. DNA navržení primerů a sond pro referenční gen a studovaný (GOI) určení standardních křivek pro oba geny a stanovení efektivity GAPDH GOI

vyhodnocení kalibrátor sample A sample B kalibrátor sample B GAPDH GOI vyhodnocení kalibrátor sample A sample B kalibrátor sample B GAPDH GOI

1 vyhodnocení metoda „delta cé té“ změny exprese pro sample 1 1. určíme CT 1 vyhodnocení metoda „delta cé té“ změny exprese pro sample 1 1. určíme CT pro všechny křivky 2. určíme CT 3. 4. GOI určíme CT - CT GOI GAPDH - CT pro kalibrátor CT kalibrátor pro sample 1 CT sample 1 GAPDH CTsample 1 - CTkalibrátor CT výsledek (kolikrát je gen více či méně exprimován) 2 - CT

2 vyhodnocení počítá se i s efektivitou Sample A - kalibrátor Sample B - 2 vyhodnocení počítá se i s efektivitou Sample A - kalibrátor Sample B - vzorek

3 vyhodnocení pomocí standardů o známe koncentraci se spočítají počty kopií ve vzorcích 3 vyhodnocení pomocí standardů o známe koncentraci se spočítají počty kopií ve vzorcích

příklad linie živočišných buněk byla podstoupena umlčení (silencing) genu pkg 2 s linie transfekované příklad linie živočišných buněk byla podstoupena umlčení (silencing) genu pkg 2 s linie transfekované a netransfekované (kalibrátor) byla izolována RNA, přepsana do c. DNA a provedeno q. PCR s primery a probou na gen pkg 2 a GAPDH (referenční gen). Snížila se exprese genu pkg 2 po umlčení? pkg 2 Eff 86% c. DNA kalibrator silencing CT 22, 48 CT 22, 3 GAPDH Eff 77% c. DNA kalibrator CT 20, 05 c. DNA silencing CT 16, 97 pkg 2 2 - CT 2 –(5, 33 -2, 43) 0, 134 7, 5 x c. DNA 1, 1 x 104 kopií 1, 23 x 104 kopií kalibrator silencing GAPDH (1+0, 86)0, 18/(1+0, 77)3, 08 0, 192 Gen snížil expresi 5, 2 x c. DNA kalibrator silencing 1, 55 x 104 kopií 8, 92 x 104 kopií 0, 194 5, 2 x

navrhování primerů velikost amplikonu 50 -150 bp délka primerů 20 bp primery se nesmí navrhování primerů velikost amplikonu 50 -150 bp délka primerů 20 bp primery se nesmí překrývat s próbou Tm 58 -60◦C optimální teplota pro degradaci proby exonukleasovou aktivitou GC obsah 50 -70% žádné vlásenky žádné dimery (self-dimery, cross-dimery)

navrhování proby délka proby 13 -25 bp primery se nesmí překrývat s próbou Tm navrhování proby délka proby 13 -25 bp primery se nesmí překrývat s próbou Tm 68 -70◦C o 10◦C vyšší než Tm primerů GC obsah 50 -70% žádné G na 5´konci zháší fluorescenci FAM barvy

navrhování primerů a proby navrhování primerů a proby

kontaminace genomickou DNA 1) ošetření vzorků před RT DNasou 2) navržení primerů do dvou kontaminace genomickou DNA 1) ošetření vzorků před RT DNasou 2) navržení primerů do dvou exonů mezi nimiž je dlouhý intron 3) navržení primeru nebo proby na přechod intron/exon

MGB PROBY • minor groove binding • stabilizuje vazbu proby na ss. DNA • MGB PROBY • minor groove binding • stabilizuje vazbu proby na ss. DNA • výrazně zvyšuje Tm • můžeme navrhovat krátké proby při zachování vysoké Tm

MGB PROBY využití pro alelické diskriminace MGB PROBY využití pro alelické diskriminace

kolik replikací a kdy replikovat? sample extrakce RNA přepis do c. DNA q. PCR kolik replikací a kdy replikovat? sample extrakce RNA přepis do c. DNA q. PCR 3 X 6 X

kolik replikací a kdy replikovat? ideální 3 x sample extrakce RNA přepis do c. kolik replikací a kdy replikovat? ideální 3 x sample extrakce RNA přepis do c. DNA q. PCR 27 X

instrumentace 7500 Real Time PCR System 7900 HT Real Time PCR System Step. ONE instrumentace 7500 Real Time PCR System 7900 HT Real Time PCR System Step. ONE Real Time PCR System

zesilovač halogenová lampa emisní filtry excitační filtry zkumavky se vzorky v peltierovém bloku ccd zesilovač halogenová lampa emisní filtry excitační filtry zkumavky se vzorky v peltierovém bloku ccd kamera

instrumentace instrumentace

http: //www. youtube. com/watch? v=k 16 Wg. EU 1 k. VM http: //www. youtube. com/watch? v=k 16 Wg. EU 1 k. VM

HRM ANALYSA (HIGH RESOLUTION MELT) • detekce SNP bez specifických sond • díky kvalitní HRM ANALYSA (HIGH RESOLUTION MELT) • detekce SNP bez specifických sond • díky kvalitní instrumentaci Corbett ( 0. 02◦C) a nové generaci interkalačních barviv (LCGreen. Plus)

HRM ANALYSA pro amplikony do 200 bp HRM ANALYSA pro amplikony do 200 bp