Курс Медицинская клеточная биотехнология Основы клеточного культивирования Кафедра

Курс: «Медицинская клеточная биотехнология» Основы клеточного культивирования Кафедра физиологии человека и животных Биологического факультета Дон. НУ Лектор: ст. преподаватель кафедры Турчин Виктор Васильевич Донецк, 2013

История XIX век – разработка раствора Рингера 1885 – разработка принципов культивирования тканей 1907 – изучение роста нервных волокон эмбриона лягушки in vitro Сидни Рингер (Sidney Ringer) 1910 – работы по изучению культур клеток саркомы цыпленка, привели к открытию онковирусов Вильгельм Ру (Wilhelm Roux) Росс Харрисон (Ross G. Harrison) 1912 – поддержание жизнеспособности работающего сердца эмбриона цыпленка ex vivo Пейтон Раус (F. Peyton Rous) Але ксис Карре ль (Alexis Carrel) 1954 Томас Уэллер Фредерик Роббинс Джон Эндерс (John F. Enders) (Thomas H. Weller) (Frederick C. Robbins) 1940– 50 -е выращивание вирусов в культурах клеток, привело к разработке вакцины против вируса полиомиелита

История Джордж Гей (George O. Gey) 1951 – получил бессмертную онкологическую линию клеток человека He. La, выделенную из клеток рака шейки матки (линия He. La была названа в честь пациентки Генриетты Лакс (Henrietta Lacks)) Клетки линии He. La 1955 – разработка культуральных сред определённого состава Гарри Игл (Harry Eagle) Минимальная питательная среда Игла (Eagle's minimal essential medium (E-MEM))

История 1960 -е – начало крупных работ по изучению клеточного слияния и гибридных клеток Генри Харрис (Henry Harris) Нильс Рингетс (Nils Ringetz) 1964 – изучение плюрипотентных свойств эмбриональных стволовых клеток Льюис Кляйнсмит Барри Пирс (Lewis J. Kleinsmith) (G. Barry Pierce) вирус бешенства (электронная микроскопия) клетки эмбриональной карциномы 1964 – выращивание вируса бешенства в культуре фибробластов человека; разработка современной вакцины против вируса бешенства Тадэуш Виктор (Tadeusz J. Wiktor)

История 1970 -е – разработка методов переноса ДНК с помощью вирусов Фрэнк Грэхем Алекс ван дер Эб (Frank L Graham) (Alex van der Eb) 1975 г синтез моноклональных антител, используя гибридомы Нобелевская премия 1984 г. Жорж Кёлер Нильс Ерне Сезар Мильштейн (César Milstein) (Georges J. F. Köhler) (Niels K. Jerne) 1975 г культура кератиноцитов Говард Грин Джеймс Рейнвальд (James G. Rheinwald) (Howard Green) кератиноциты

История 1978 г. - разработка бессывороточной среды Ричард Хэм Уолес Мак. Киан (Richard G. Ham) (Wallace L. Mc. Keehan) 1981 г. – получение культуры мышиных эмбриональных стволовых клеток 2007 Мартин Эванс (Martin J. Evans) Гэйл Мартин (Gail R. Martin)

История 1998 г. – получил культуру эмбриональных стволовых клеток человека 2007 г. – получил культуру и. ПСК человека Джеймс Томсон (James A. Thomson) 2006 г. – получил культуру и. ПСК мыши 2012 Синъя Яманака (Shinya Yamanaka)

Факторы, способствовавшие развитию культуральной техники Антибиотики Рекомбинантные белковые факторы Коммерческие питательные среды и сыворотки Биоэтика, защита животных Техника клеточного и тканевого культивирования Генетика Онкология Биопроизводство Токсикология Вирусология Клеточная транспланстология и тканевая инженерия Области применения культуры ткани

Преимущества метода культуры клеток и тканей Категория Физико-химические свойства окружения Преимущества Контроль р. Н, температуры, осмотического давления, парциального давления растворённых газов Физиологическое состояние Контроль уровня гормонов и концентраций питательных веществ Микроокружение Регуляция матрикса, межклеточных взаимодействий, газовой диффузии Однородность клеточных Доступность селективных сред, клонирование линий Характеристика Цитология и иммунное окрашивание легко осуществимо Сохранение Может храниться в жидком азоте Сертификация и Происхождение, история и чистота культуры аккредитация могут быть проверены на аутентичность и документированы Повторяемость и Количественный анализ легко осуществим воспроизводимость результатов Экономия реагентов Использование меньших объёмов

Ограничения метода культуры клеток и тканей Категория Необходимость наличия специальных навыков Контроль окружающей среды Объём расходов и стоимость Генетическая нестабильность Фенотипическая нестабильность Идентификация типов клеток Примеры Стерильность манипуляций, химические загрязнения, микробное загрязнение, перекрёстное загрязнение Рабочее место, культивирование, контроль p. H, предотвращение биозагрязнения окружающей среды и утилизация отходов Основное оборудование для производства в больших масштабах, среды, сыворотки, одноразовое пластиковое оборудование Разнородность, изменчивость Обратная дифференцировка, адаптация, избирательный чрезмерный рост Маркеры не всегда экспрессированы; сложно восстановить гистологическую принадлежность, атипичность клеток; геометрия пространства и микроокружения изменяют цитологию

Основные отличия культур клеток in vitro от таковых in vivo in vitro трехмерная (3 D) конфигурация клеток в тканях двухмерная (2 D) конфигурация клеток на плоском субстрате специфические межклеточные взаимодействия их утрата в ткани присутствуют многие типы клеток стабильная клеточная культура (не первичная) представлена, как правило, одним типом клеток большинство типов клеток не- или малоподвижны приобретают высокую подвижность нейрогуморальная регуляция физиологических процессов в клетках отсутствие этой регуляции (но возможен искусственный контроль уровня гормонов в культуральной среде) основа энергетического метаболизма дыхательные процессы энергетический метаболизм основан на гликолизе и, в меньшей степени, цикле Кребса

Типы культур по объектам культивирования Органная/тканевая культура Клеточная культура Адгезивная культура Монослойная Гистотипическая культура Суспензионная культура Органотипическая культура

Стадии развития клеточных культур Первичная культура Эксплантационная культура Диспергированная первичная культура Первый пассаж Клеточная линия

Органная/тканевая культура Лёгкие эмбриона

Органная/тканевая культура Фрагменты кожи

Клеточная культура Адгезивная культура Пролиферативная стадия Стадия монослойной культуры

Клеточная культура Монослойные стадии культур клеток разного типа Эпителий Эндотелий Фибробласты

Гисто-/органотипическая культура Гистотипическая культура кератиноцитов Агрегация клеток Органотипическая культура – тканевой эквивалент кожи (схема)

После первого пассажа Первичная культура Диспергированная первичная культура

Диспергированная первичная культура Клетки карциномы молочной железы мыши Бутыль для суспензионных культурна магнитной мешалке

Эксплантационная первичная культура Уротелий Кератиноциты кожи

Влияние окружения на культуру Природа субстрата Состав газовой фазы Культура Степень контакта с другими клетками Температура инкубации Физикохимический и физиологический состав среды

Клеточная адгезия

Молекулы клеточной адгезии (САМs)

Молекулы клеточной адгезии (САМs) Са-независимая САМ Кадгенин Интегрин

Клеточная адгезия Заряженный субстрат Адгезия молекул ВКМ к субстрату, прикрепление клеток к ВКМ и распластывание Синтез молекул ВКМ клетками Трипсинизация трипсин Ca 2+ ЭДТА трипсин Заряженный субстрат

Компоненты экстраклеточного матрикса Ламинин, схема Ламинин (электронная микроскопия) Коллаген 1 типа (схема)

Компоненты внеклеточного матрикса Фибронектин (схема) Фибронектин соединяет интегрины и внеклеточный коллаген Протеогликаны матрикса (схема)

Клеточная подвижность (полярный фибробласт)

Клеточная подвижность (фибробласты и эпителиальные клетки)

Клеточная подвижность Мышиные фибробласты модель искусственной раны Фибробласты циплёнка Клетки меланомы мыши Эпидермальные кератоциты радужной форели

Компоненты цитоскелета (электронные микрофотографии, метод негативного окрашивания) Микротрубочки (25 нм диам. ) и актиновые филаменты (8 нм диам) (клетки меланомы В 16) Промежуточные микрофиламенты (10 нм диам. ) (эпителиальные клетки)

Схематическое представление актинового цитоскелета у поляризованных фибробластов в движении

Актиновый цитоскелет (электронная микрофотография) филоподия ламеллиподия a - Сократительные пучки актина if – промежуточные микрофиламенты mt – микротрубочки

Сайты адгезии Формирование новых адгезивных сайтов Адгезивные сайты (фибробласты серебристого карася) Зелёный – актин Красный – винкулин (адгезивный сайт) Ретракция

Взаимодействие микротрубочек и адгезивных сайтов (схематично)

Клеточный цикл

Фазы митоза

Контрольные точки клеточного цикла

Регуляция клеточного цикла

Примеры растворимых факторов влияющие на клеточную пролиферацию EGF – эпителиальный фактор роста (фактор роста эпителиальной ткани) PDGF – тромбоцитарный фактор роста (стимулирует рост клеток мезенхимного происхождения, эндотелиоцитов, клеток глии и др. ) IGF-1 – инсулиноподобный фактор роста (митоген для многих типов клеток, эффект подобен инсулину) b. FGF (стимулирует рост мезенхимных клеток) + TGF-β – трансформирующий фактор роста (индуцирует активность Ink-комплекса)

Клеточная дифференцировка Недифференцированная клетка Дифференцировка Изменение условий культивирования Специфические индукторы *культивирование при высокой плотности; *биологически активные вещества (гормоны, витамины, факторы роста, цитокины); *усиление межклеточных или клеточно-матричных взаимодействий; *изменение состава среды *органические и неорганические химичесике вещества; *матриксы и другие 3 D структуры Дифференцированная клетка

Дифференцировка МСК Интактные МСК Адипоциты Остеобласты Хондроциты

Остеогенная дифференцировка МСК Интактные МСК Индукторы: Глицерофосфат; Дексаметазон; Аскорбиновая кислота Остеогенная дифференцировка 4 недели

Хондрогенная дифференцировка МСК Культура при плотном скоплении Индукторы: Окраска safranin O Инсулин; Дексаметазон; Трансферрин; Линоленовая кислота; Пролин; TGFβ

Причины потерь специализированных свойств клеток in vitro МСК Дедифференцировка (конверсия до более примитивного фенотипа) Специализированная клетка Клетка-предшественник Деадаптация (обратимая потеря специализированных свойств) Специализированная клетка (не функционирует) Специализированная клетка Селекция (избирательный рост нецелевого типа клеток) Специализированная клетка (популяция) Нецелевая клетка (популяция)

D-циклин/RB путь регуляции клеточного цикла Мембранный рецептор R Активация D-циклин D- Клеточная мембрана CDK-4/6 D + p 16 - CDK-ингибитор комплекса Ink 4 P АРС p. RB E 2 F G 1 -фаза - β-catenin P p. RB E 2 F + + Активация генов начала клеточного цикла в ядре D Переход в S-фазу + c-Myc

Ретинобластома Развитие ретинобластомы связано с мутацией RB гена

Семейный аденоматозный полипоз Эндоскопическая фотография сигмовидной кишки В 80% случае этого типа рака наблюдается мутация гена АРС

p 53 зависимый контроль перехода контрольной точки G 1/S Повреждение ДНК Задержка в контрольной точке G 1/S Ядерный PCNA антиген клеточной пролиферации + Репарация ДНК p 21 - C Блокирование CDK-циклиновых комплексов p 53 CDK p 53 -зависимый апоптоз (если репарация ДНК невозможна)

Апоптоз в процессе онтогенеза Апоптоз в процессе развития лапы мыши Синдактилия (результат нарушения механизма апоптоза в процессе развития)

Баланс между клеточным делением и клеточной гибелью

Физиологический апоптоз Механизм селекции T-лимфоцитов в тимусе Апоптоз в эритроцитах лягушки

Программированная клеточная гибель (апоптоз) Общая схема апоптоза Категории апоптоза по функциональному значению 1) гибель бесполезных клеток; 2) гибель избыточных клеток; 3) гибель неправильных или повреждённых клеток; 4) гибель рудиментарных клеток; 5) гибель вредоносных клеток.

Различия между апоптозом и некрозом Апоптоз Инициируется клеточной программой или сигналом клеточной гибели Целостность плазматической мембраны сохраняется Ультраструктура органелл не нарушается (за исключ. ЭПР) Объём клетки уменьшается (сморщивание) Ядро фрагментируется Воспалительная реакция не происходит Частично активный процесс (может происходить синтез белков механизма апоптоза, но не обязательно) Некроз Инициируется интенсивным или продолжительным действием повреждающего фактора Целостность плазматической мембраны нарушена Объём клетки увеличивается (набухание) Нарушение ультраструктуры органелл (напр. , набухание митохондрий) Ядро не подвергается изменениям Вызывает интенсивную воспалительную реакцию Пассивный процесс

Апоптоз (морфологические признаки) Интактные клетки После индукции апоптоза

Апоптоз Нормальная культура После индукции апоптоза

Апоптоз (морфологические признаки) Ядра окрашены Hoechst 33342 Конденсация ядерного материала Формирование апоптотических телец

Апоптоз (электрофореграмма ДНК) Норма Апоптоз Некроз

Индукторы апоптоза 1. Мембранные рецепторы апоптотических сигналов * белки семейства TNFR (TNF-R 1, Fas, DR 3/4/5) (механизм защиты от случайной активации – белки типа Decoy и SODD) * интегрины (эндотелиальные и эпителиальные клетки) 2. Повреждение ДНК p 53 -зависимый апоптоз 3. Стресс * удаление из среды факторов роста или сыворотки * активные кислородные радикалы (ROS) 4. Кальциевый гомеостаз Резкое повышение или понижение внутриклеточного уровня ионов кальция Эффекторы апоптоза Регуляторы апоптоза Каспазы (ответственны за разрушение компонентов цитоскелета клетки) Агонисты Эндонуклеазы (ответственны за фрагментацию хроматина) Трансглютаминазы (ответственны за сшивание (полимеризацию) белков) TNF , Bax Антагонисты Bcl-2, Bcl-XL, NAIP