Курс лекций Медицинская генетика История развития генетики человека

Курс лекций «Медицинская генетика» История развития генетики человека

• Литература • Ф. Фогель, А. Мотульски. Генетика человека. Т. 1 3. М: Мир. 1990. • Н. П. Бочков. Клиническая генетика. М: Медицина. 1997 • Н. П. Бочков. Клиническая генетика. Второе издание М: Гэотар-Мед. 2001 • Гинтер Е. К. Медицинская генетика. М: Медицина. 2003 • В. Н. Горбунова, В. С. Баранов. Введение в молекулярную диагностику и генотерапию наследственных заболеваний. СПб: Специальная литература. 1997 • И. Ф. Жимулёв. Общая и молекулярная генетика. Новосибирск, 2002 • Иванов В. И. Генетика. М: Академкнига, 2007 • В. П. Пузырев, В. А. Степанов. Патологическая анатомия генома человека. Новосибирск: Наука. 1997

Предмет и задачи медицинской генетики Генетика человека Медицинская генетика Клиническая генетика • • • Геномика Геномная медицина Генетика человека: это наука о наследственности и изменчивости в приложении к человеку Медицинская генетика: роль наследственности в патологии человека, закономерности передачи из поколения в поколение наследственных болезней, методы диагностики, лечения и профилактики наследственной патологии, включая болезни с наследственной предрасположенностью Клиническая генетика: применение знаний и разработок в области мед. генетики к клиническим проблемам (диагностика, лечение, прогноз и профилактика) Геномика: структурная и функциональная организация и изменчивость генома (Томас Родерик, 1989) Геномная медицина: применение знаний и разработок геномики и молекулярной

Медицинская генетика, составляя важнейшую часть теоре тической медицины, рассматривает в связи с патологией следующие вопросы: – какие наследственные механизмы поддерживают гомеостаз организма и определяют здоровье индивида; – каково значение наследственных факторов (мутации или сочетание определенных аллелей) в этиологии болезней; – каково соотношение наследственных и средовых факторов в патогенезе болезней; – какова роль наследственных факторов в определении клинической картины болезней (и наследственных, и ненаследственных); – влияет ли (и если влияет, то как) наследственная конституция на процесс выздоровления человека и исход болезни; – как наследственность определяет специфику фармаколо гического и других видов лечения. Для врача образование по медицинской генетике включает в себя основы общей генетики (менделизм, учение о хромосомах, химические основы на следственности), основные положения генетики человека (человек как объект генетического исследования) и клиническую генетику.

• Клиническая генетика в строгом смысле слова — прикладной раздел медицинской генетики, т. е. применение достижений последней для решения клинических проблем у пациентов или в их семьях. • Эти проблемы следующие: как поставить правильный диагноз, как помочь больному (лечение), как предупредить рождение больного потомства (прогноз и профилактика). • В настоящее время клиническая генетика основывается на геномике, цитогенетике, биохимической генетике, иммуногенетике, формальной генетике, включая популяционную и эпидемиологическую, генетике соматических клеток и молекулярной генетике.

Значение генетики для медицины • > 11000 наследственных болезней, поражающих все органы, системы и функции организма • Распространенность НП у детей: 5 -5, 5% новорожденных • Генные болезни - 1% • Хромосомные болезни - 0, 5% • Болезни с наследственной предрасположенностью - 3 -3, 5% • Несовместимость матери и плода - 0, 4% • Генетические соматические нарушения - ? • Причины детской смертности: до 50% в пери- и неонатальной смертности - ВПР, НБ и другие «генетические» причины • Генные болезни - 8 -10% • Хромосомные - 2 -3% • Мультифакториальные (генетич. предрасположенность) - 35 -40%) • Негенетические причины - 50% • Смена «профиля» НП с возрастом при постоянстве «груза»

Краткая история генетики человека и медицинской генетики • Исторически сложилось так, что в странах Запада генетика человека развивалась как целостная научная дисциплина, в рамках которой и генетика нормы, и генетика патологии шли рядом. У нас же по разным причинам возникла асимметрия – преимущественное внимание уделялось медицинским аспектам, а генетика здорового человека оставалась в тени. И на этом направлении у нас наметилось значительное отставание.

Оглядываясь назад Ф. Гальтон основоположник генетики человека • "Он знал математику и физику больше, чем девять биологов из десяти, больше из биологии, чем девятнадцать математиков из двадцати, и больше из патологии и физиологии, чем сорок девять из пятидесяти биологов и математиков его времен". Карл Пирсон

• • • Френсис Гальтон родился 16 февраля 1822 года, в семье зажиточного английского банкира Самуэля Гальтона, он был девятый и последний в семье сын. Он рос вудеркиндом. В полтора года Френсис знал алфавит, в два с половиной стал читать, а в три писать; в четыре года он уже знал наизусть стихи по латыни, арифметику и немного французский язык, в шесть всю английскую классическую литературу, включая Шекспира; при этом, прочтя страницу дважды, он повторяет ее слово в слово наизусть. По настоянию отца в 1840 году Френсис поступил в Кембриджский университет, где он учился на врача, но к концу обучения охладел к выбранной профессии, получил естественно научное образование и занялся географией. Френсис Гальтон прожил долгую жизнь (1822 1911), и с возрастом круг его интересов неизменно расширялся. Это был, по словам К. А. Тимирязева, “один из оригинальнейших ученых исследователей и мыслителей современной Англии”. Круг интересов Гальтона был чрезвычайно широк: в молодости он много путешествовал, занимался этнографией и географией человека; увлекался метеорологией; после он изучал наследственность человека, талант и способности, разработал методику генеалогического анализа (изучения родословных); впервые использовал метод исследования близнецов в биологии и в психологии (“близнецовый анализ”); внес немалый вклад в теорию статистики, в частности, первым применил статистический анализ в биологии человека и психологии; был одним из основоположников экспериментальной психологии и первым ввел в нее применяемые теперь так широко психологические тесты и опросники; разработал антропометрию исследование человека путем измерения его внешних анатомических признаков, в частности, занимался дактилоскопией исследованием кожных пальцевых узоров; он же был основоположником евгеники учения об улучшении наследственности человека. Венцом научной работы этого периода творчества стала книга "Наследственный гений"(1869), позднее неоднократно переиздававшаяся. В книге проанализирован обширный материал по так называемым "выдающимся людям". В своих рассуждениях автор подошел к пониманию феномена нормального распределения признаков в человеческой популяции.

Фрэнсис Гальтон «Наследственный талант и характер» (1865) «Наследственный гений: исследование его законов и следствий» (1869) «Очерки по евгенике» (1909) • Выяснение принципов наследования у человека началось не с менделизма. Иной подход, отличный от менделевского, был сформулирован Ф. Гальтоном в работе «Наследование таланта и характера» (1865) и в его более поздних работах. Гальтон изучал наследование таких признаков, как интеллект, работоспособность, внешние данные. Он считал, что при исследовании определенных свойств личности следует возможно более точно количественно оценить эти свойства и затем сопоставить полученные оценки для индивидов со степенью родства, используя статистические методы. Он делает выводы, что отдельные наблюдения обманчивы и только статистический подход может быть адекватным.

• При таком подходе механизмы наследования объяснить невозможно. Но при изучении человеческих характеров этот подход может быть более полезен, чем менделевский. Анализ родословных в соответствии с законами Менделя чаще всего не позволял разделить большинство индивидуальных особенностей на определенные типы, как это возможно в случае гладких и морщинистых горошин. Человеческие характеры, как правило, не имеют однозначных различий и не образуют в популяции четко различающиеся группы. Кроме того, фенотип в огромной мере зависит от окружающей среды, а не только от генотипа, он есть «взаимодействие врожденного и приобретенного» (по Гальтону). Поэтому попытки объяснить особенности характера с помощью законов Менделя не могли привести к успеху. Наследование таких свойств личности как интеллект и характер, а также многих наследственных заболеваний, случаи умственной отсталости можно было изучать либо так, как предлагал Гальтон, либо вообще не изучать.

• Начиная с 1900 года и до наших дней две концепции – менделевское представление о гене и биометрический подход Гальтона – развивались параллельно. Эти подходы – менделевский и биометрический – не исключают друга, во многих случаях они даже друга дополняют. •

• Гальтон проанализировал множество биографий выдающихся людей, чтобы выяснить, насколько часто они состояли в родстве. Полученные цифры оказались намного выше, чем можно было ожидать для случайного распределения. • Сам Гальтон предостерегал о возможной ошибочности выводов, сделанных на основе таких данных. Он подчеркивал, что «когда отец достиг высокого положения, его сын будет поставлен в более благоприятные условия для продвижения, чем если бы он был сыном обычного человека» . Социальное положение особенно важно для роста успеха на государственной и военной службах…» • Тем не менее, в областях деятельности более открытых для всех (например, в науке и литературе) он обнаружил высокий процент близких родственников среди людей, достигших успеха. • На основании своих исследований Гальтон сделал вывод о том, что большие способности и достижение известности сильно зависят от наследственности.

• В первое десятилетие 20 века биометрический метод Гальтона привел исследователей к значительным успехам. Появились представления о генетической изменчивости как нормальных признаков, таких как телосложение и интеллект, так и широкого круга патологий, таких как умственная отсталость и психозы, или соматических заболеваний – сахарный диабет, аллергия. Наряду с этим появились важнейшие достижения в менделевской генетике человека: в частности, доказательство трехаллельного наследования групп крови АВ) (Бернштейн, 20 е годы 20 в. ).

• Сильное влияние на развитие генетики человека оказало, возникшее в 40 – 50 х годах новое направление – молекулярная биология. Так, в 1949 г. Поллинг с соавторами объяснил причину серповидноклеточной анемии. Эта болезнь – следствие аномалий в структуре молекулы гемоглобина. • Таким образом, эти два направления развивались параллельно, дополняя друга.

• Однако еще задолго до открытия Менделя были описаны патологические наследственные признаки у человека. Первые сведения о передаче наследственной патологии содержатся в: • – Талмуде (4 в. до н. э. ), в котором указано на опасность обрезания крайней плоти у мальчиков, старшие братья которых или дяди по материнской линии страдают кровотечением. • – К 18 веку относятся первые описания доминантного (полидактилия, т. е шестипалость) и рецессивного (альбинизм у негров) признаков, сделанных французским ученым П. Мопертюи. • – В начале 19 в. несколькими авторами одновременно было описано наследование гемофилии.

• – В 1814 г. вышла книга лондонского врача Д. Адамса «Трактат о предполагаемых наследственных свойствах болезней, основанный на клиническом наблюдении» . В нем Адамс сформулировал многие важные принципы медицинской генетики: «Браки среди родственников повышают частоту семейных (т. е. рецессивных) болезней. Наследственные (т. е. доминантные) болезни не всегда проявляются сразу после рождения, но могут развиваться в любом возрасте» . «Не все врожденные болезни являются наследственными, часть из них связана с внутриутробным поражением плода (например, за счет сифилиса).

• – В. М. Флоринский (1865) – «Усовершенствование и вырождение человеческого рода» • Указывал на вред близкородственных браков, наследственный характер многих патологий, в том числе, глухонемоты, альбинизма, заячьей губы и др.

• – Особого внимания заслуживают исследования известного английского клинициста А. Гэррода (1857 – 1936). Его работа «Распространенность алкаптонурии: изучение химических особенностей» несла ряд новых идей. Гэррод первым обнаружил связь между генами и ферментами, открыл врожденные нарушения обмена веществ и положил начало биохимической генетике. • – в 1900 г. К. Ландштейнер описал систему групп крови АВ 0. • – В 1924 г. Ф. Бернштейн установил, что АВ 0 система групп крови человека контролируется серией множественных аллелей одного локуса. Спустя 25 30 лет был обнаружен резус фактор.

Практическое значение • Развитие различных подходов и методов в генетике человека привело к появлению множества отдельных специальных разделов этой науки. Многие из них перекрываются и не являются единственными в своем роде. Биохимическая генетика – человека включает биохимию нуклеиновых кислот и ферментов у здоровых и больных людей. • Цитогенетика человека – изучает хромосомы человека в норме и патологии. • Иммуногенетика человека – это в значительной мере генетика групп крови и тканевых антигенов.

• Формальная генетика – изучает наследование менделевских признаков. Генетика поведения – наука, изучающая наследственные факторы, детерминирующие поведение здоровых и больных людей. • Фармакогенетика – занимается изучением генетических факторов, определяющих метаболизм лекарственных препаратов в организме.

Клиническая генетика – решает методы диагностики, прогнозирования и, в известных пределах, лечения наследственных заболеваний. • Развитие молекулярной биологии и хромосомных исследований не только изменило генетику человека как «чистую» науку, но и привело к использованию ее достижений для охраны здоровья людей. Вначале улучшилась диагностика заболеваний, была выявлена связь между пороками развития и хромосомными аберрациями. • В начале 50 х годов выяснение биохимической природы дефектов при фенилкетонурии и галактоземии привело к разработке специальных диет, предотвращающих эти заболевания. • Важнейшим событием стало появление в начале 70 х годов методов пренатальной диагностики хромосомных аберраций и некоторых дефектов метаболизма. Оказалось, что медико генетическая консультация может основываться не только на вероятностных прогнозах, но и на достоверных диагнозах. • Потребность в медицинской диагностике послужила стимулом для фундаментальных исследований, в том числе, роли половых хромосом, генетический анализ «супергена» комплекса гистосовместимости, нестабильность хромосом, их поломки и возникающие соматические мутации, приводящие к злокачественным образованиям.

Генетика человека в России Н. К. Кольцов Гипотеза о молекулярном строении и Матричной репродукции хромосом (1928). Организатор и председатель Русккого евгенического общества (1921 1929). Евфеника – «учение о хорошем проявлении Наследственных задатков» С. Н. Давиденков Идея создания каталога генов (1925). Первая в мире медико генетическая консультация (1929) Премия Давиденкова РАМН А. С. Серебровский Термин «генофонд» (1927) Генетика популяций, структура гена С. Г. Левит Основатель первого медико генетического института (1935) Современные центры генетики человека Медико генетический научный центр РАМН, Н. П. Бочков Москва Академик РАМН Институт медицинской генетики СО РАМН, Томск Основатель и первый Ин т акушерства, гинекологии и перинатологии директор РАМН, СПБ Института медицинской Ин т общей генетики, Москва генетики Институт цитологии и генетики, Новосибирск (МГНЦ) Институт биохимии и генетики, Уфа

Генетика человека, евгеника и политика • На многих ученых биологов оказали сильное влияние представления приверженцев евгеники – практически всеобъемлющем влиянии генетических факторов на развитие нормальных физиологических и умственных способностей, а также на появление умственной отсталости, психических заболеваний, алкоголизма, преступности и др. Они пришли к выводу, что человеческому виду следует заняться своим улучшением и для этого поддерживать воспроизводство людей с желаемыми качествами (позитивная евгеника) и препятствовать воспроизводству больных, умственно отсталых и калек (негативная евгеника).

• В США и Англии были организованы учреждения, занимающиеся исследованиями в области евгеники. Со временем серьезные генетики разочаровались в идеях евгеники. Однако такие тенденции имели несколько важных политических последствий. Например, в некоторых штатах Америки были введены законы, которые давали возможность насильственно стерилизовать людей за наличие у них преступных наклонностей. Были приняты законы, ограничивающие иммиграцию в США. Сторонники евгеники стремились показать, что выходцы из Северной и Центральной Европы приносят больше пользы государству, чем выходцы из Южной Европы или Средней Азии. Аналогичные тенденции имели место и в Англии.

• В Германии евгеника стала называться «расовой гигиеной» . Движение под этим названием было связано с представлением о превосходстве нордической расы, страхом вырождения человечества в целом и немецкого народа, в частности, от алкоголизма, сифилиса и за счет увеличения рождаемости слабоумных или людей из низших слоев общества. Эти взгляды проповедовались за 2 года до прихода к власти Гитлера (в 1931 г). В 1933 г. был введен закон о стерилизации (пришел Гитлер – исследования в концлагере Аушвиц). Законы, предусматривающие добровольную стерилизацию, примерно в то же время были введены и в Скандинавских странах.

• В СССР в 20 -е годы (1921) под влиянием идей евгеники было организовано Русское евгеническое общество, в 1922 г. В Петрограде Ю. А. Филипченко создал Бюро по евгенике. Эти евгенические организации ориентировались сугубо на научные задачи в отличие от евгенических обществ других стран. Н. К. Кольцов, Ю. А. Филипченко проводили работы по генетике одаренности, изучая родословные выдающихся личностей. Однако эти исследования грешили методическими ошибками, противоречиями, определенным примитивизмом. Вместе с тем были в евгенических работах и положительные моменты. Так, Кольцов и Филипченко правильно ставили вопрос о значении социальных условий в реализации индивидуальных особенностей человека, полностью отвергали насильственный путь улучшения наследственности человека. Кроме того, силами советских евгеников были собраны родословные выдающихся личностей, например, А. С. Пушкина, Л. Н. Толстого, А. М. Горького, Ф. И. Шаляпина и др. К концу 20 х годов евгенические исследования в нашей стране были прекращены.

• В ряде стран, в том числе, и в нашей, начинает развиваться медицинская генетика. С 1932 по 193 гг. работал Московский медико биологический институт им. М. Горького (позднее Медико генетический институт), возглавляемый С. Г. Левитом. При нем был организован Центр близнецовых исследований. Здесь изучались болезни с наследственным предрасположением – диабет, язвенная болезнь, аллергия, гипертоническая болезнь и др. Большой интерес имели цитогенетические работы по идентификации хромосом человека. • К концу 30 х годов 20 в. интерес к генетике человека начал снижаться.

• С приходом к власти Т. Д. Лысенко (30 е годы) все генетические исследования, в т. ч. и человека, были запрещены вплоть до начала 60 х годы (30 лет генетика – лженаука). • Возрождение советской генетической науки началось после разоблачения «учения» Лысенко. В 1964 г. издан учебник В. П. Эфрoимсона по медицинской генетике, в 1969 г. открыт Институт медицинской генетики под руководством Н. П. Бочкова (в настоящее время – Научно исследовательский центр медицинской генетики РАМН), где начались широкие исследования по многим направлениям медицинской генетики.

• В 1956 г. Х. Тио и А. Леван установили, что в клетках человека содержится 46 хромосом, а спустя 3 года – открыты хромосомные болезни человека. В 1959 г. Дж. Лежен установил цитогенетическую картину возникновения синдрома Дауна. • Еще одним этапом развития современной генетики человека явилось картирование и локализация генов в хромосомах человека. В настоящее время установлено 23 группы сцепления. • Во второй половине 20 в. начала интенсивно развиваться молекулярная генетика и генная инженерия. В 1969 г. индийский ученый Г. Карано впервые осуществил искусственный синтез гена. С помощью генной инженерии получены искусственные гены инсулина, интерферона, соматотропина и др.

• Конец 20 в. ознаменован разработкой и началом осуществления международной программы «Геном человека» . Ее задача – изучение генома человека, включая картирование хромосом и секвенирование их ДНК, определение полной нуклеотидной последовательности генома, состоящего из трех миллиардов пар нуклеотидов. В рамках этой программы разрабатываются методы диагностики и лечения наследственных болезней. В настоящее время (Шевченко В. А. , 2002)уже возможна ДНК диагностика более 100 наследственных дефектов.

• Примером взаимодействия генетики и общества является принятие на пороге нового века закона в Исландии, разрешающего местной биотехнологической компании создавать базу данных с информацией о структуре ДНК каждого из жителей этой страны (270000 жителей). Эта генетическая информация будет соотнесена с данными медицинской карты каждого исландца и с его родословной, а также с данными въезжающих в страну, и в последующие десятилетия поступит к исследователям всего мира. • Интерес генетиков к жителям этой маленькой страны объясняется многими причинами. Население Исландии уникально по своей генетической однородности и доступности для исследователей. Почти все исландцы генетически очень близки между собой, а также близки своим предкам – викингам, заселившим остров более 1000 лет тому назад. Вот почему генетики считают исландскую популяцию исключительно ценной для изучения наследственных болезней.

• Медицинские сведения о каждом исландце имеются в государственной системе здравоохранения, начиная с ее становления в 1900 году. Родословные всех проживающих в Исландии также вполне доступны. • Другая сторона вопроса, вызывающая споры среди приверженцев новой генетической технологии – конфиденциальность сведений и механизмы обмена такой информацией. • Основной вопрос, который задают научному сообществу, заключается в том, как реально можно использовать столь масштабную информацию. К примеру, каким образом можно использовать знания о полной нуклеотидной последовательности генома человека.

МЕТОДЫ ИЗУЧЕНИЯ ГЕНЕТИКИ ЧЕЛОВЕКА • Цитогенетический метод – микроскопическое изучение хромосом человека. Развитие современной цитогенетики человека связано с именами цитологов Д. Тио и А. Левана. В 1956 г. они первыми установили, что у человека 46 (а не 48, как думали раньше) хромосом, что положило начало широкому изучению митотических и мейотических хромосом человека. • В 1960 г. в г. Денвере (США) была разработана первая Международная классификация хромосом человека. В ее основу легли размеры хромосом и положение первичной перетяжки – центромеры. Все хромосомы по форме подразделены на метацентрические, субметацентрические и акроцентрические и подразделены на 7 групп, обозначенных латинскими буквами A, B, C, D, E, F и G. Каждая пара хромосом наделена порядковым номером от 1 до 22, выделены отдельно и поименованы латинскими буквами – X и Y половые хромосомы. Важным параметром при идентификации хромосом является центромерный индекс, который отражает отношение (в%)длины короткого плеча к длине всей хромосомы.

• • • Группа хромосом. Номер по кариотипу. Размер, мкм. Характеристика хромосом 1, 2, 34, 56– 1213– 1516– 1819– 2021– 222323 A (I) B (II) C (III) D (IV) E (V) F (VI) G (VII) X хромосома (относится к группе Ш)Y хромосома 11 8, 37, 77, 2 5, 74, 23, 6 3, 22, 3 2, 81 и 3 – метацентриче ские, 2 крупная субметацентрическая. Крупные субметацент рические Средние субметацентрические. Средние акроцентрические. Мелкие субметацентрические. Самые мелкие метацентрическ. Мелкие акроцентрические. Средняя субметацентрическая. Мелкая акроцентрическая

• В 1971 г. на IV Пражской конференции генетиков в дополнение к Денверской классификации были представлены методы дифференциальной окраски хромосом, благодаря которым каждая хромосома приобретает свой неповторимый рисунок, что помогает точной идентификации.

• Генеалогический метод – составление родословной и последующий ее анализ. Предложен английским ученым Ф. Гальтоном в 1865 г. Позволяет выявить наследственный характер признака и определить тип наследования. Дает возможность установить сцепленное наследование, тип взаимодействия генов и пенетрантность аллелей. Лежит в основе медико генетического консультирования. Составление родословной

• Близнецовый метод. • Монозиготные близнецы (однояйцевые). Сиамские – Чанг и Энг (ныне Таиланд), род. 1811 г. , прожили 63 года, были женаты на сестрах близнецах. Чанг произвел на свет10, а Энг – 12 детей. • Дизиготные близнецы. В Европе частота появления – 8 на 1000 населения. Полагают, что многоплодие генетически обусловлено, однако это справедливо лишь для дизиготных близнецов.

• Популяционно-статистический метод. • Биохимический метод. Причиной многих врожденных нарушений метаболизма являются различные дефекты ферментов, возникающие вследствие мутаций. Б/х методы – электрофорез, хроматография, спектроскопия и др. Объекты биохимического анализа моча, пот, плазма и сыворотка крови, форменные элементы крови, культуры клеток(фибробласты, лимфоциты)

• Метод генетики соматических клеток. Культивирование отдельных соматических клеток человека и получение из них клонов, а также их гибридизацию и селекцию. С помощью метода гибридизации соматических клеток: • а) изучают метаболические процессы в клетке; • б) выявляют локализацию генов в хромосомах; • в) исследуют генные мутации; • г) изучают мутагенную и канцерогенную активность химических веществ. • В настоящее время выснено, что в Х хромосоме локализовано 95 генов, в 1 й аутосоме – 24 гена. Ген, определяющий группу крови по системе АВ 0, расположен в ( й хромосоме, группы крови по системе МN во 2 й хромосоме, а по системе резус фактор (Rh) – в 1 й хромосоме. Обнаружены в геноме человека сверхизменчивые участки ДНК (минисателлиты), характерные для каждого человека. Выявлены последовательности ДНК, изменяющиеся с повышенной частотой. Они локализованы по всему геному и имеют разное число копий. Число и распределение таких мест индивидуально у каждого человека. На основе этих последовательностей созданы маркеры ДНК. Их применение (радиоавтография) позволяет установить место гена на хромосоме. Так, недавно установили, что ген гиперкератоза( патологическое утолщение кожных покровов и образование язв на коже) человека лежит – в 17 хромосоме, а ген болезни Альцгеймера – в 21 хромосоме.

• Молекулярно-генетические методы. В 1972 г. , были разработаны соответствующий инструмен тарий методы и манипуляции с ДНК in viiro, что позволило создать технологии рекомбинантных ДНК. До 1970 г. были неизвестны удобные и правильные методы работы с ДНК; это означало, что нельзя было исследовать индивидуальные гены непосредственно. Технология рекомбинантных ДНК стала возможной в результате выделения и биохимической характеристики ферментов, которые бактерии используют для манипуляций с ДНК в процессе своей нормальной жизнедеятельности. Очень скоро стало ясно, что если эти ферменты выделить в чистом виде, то их можно использовать для создания новых комбинаций различных фрагментов ДНК in vitro. Такие новые фрагменты назвали рекомбинатными молекулами ДНК.

Основные ферменты, используемые для манипуляций с ДНК • Эндонукпеазы рестрикции (рестриктазы). Это бактериальные ферменты, которые расщепляют молекулы ДНК внутри участков с определенной последовательностью, что позволяет делить большие молекулы ДНК на заранее известные фрагменты. Фермент расщепляет обе цепи ДНК, причем одноцепочечные разрывы могут располагаться точно друг против друга (образуются «тупые» концы) или с некоторым смещением друг относительно друга (образуются «липкие» концы).

• ДНК-лигазы. Это ферменты, которые соединяют ковалентно (лигируют) фраг менты ДНК Некоторые из них могут со единять тупые концы, а другие — только липкие. Совместимость перекрывающихся фрагментов зависит от используемых эндонуклеаз рестрикции. • ДНК-полимеразы. Это ферменты, которые синтезируют ДНК на матрице в соответствии с принципом комплементарности. Для мечения ДНК, секвенирования ДНК, полимеразной цепной реакции и обратной транскрипции м. РНК в к. ДНК используются различные ДНК полимеразы.

• Ферменты, модифицирующие ДНК. В каче тве примеров можно привести: щелочную фосфатазу (удаляет фосфатные группы с концов фрагментов ДНК) и полинуклеотидкиназу (катализирует обратный процесс). Эти ферменты используются для регулирования реак ий лигирования и для мечения ДНК.

ГЕНОМ ЧЕЛОВЕКА • Размер гаплоидного генома человека оценивают в 3 х109 н. п. (по данным Шевченко 7, 1 х 109 н. п. ) • Примерно 30% генома составляют повторяющиеся последовательности с разной степенью повторяемости. • Фракция высокоповторяющейся ДНК (106 копий) составляет примерно 8 – 12% всей ДНК. Часть таких повторов имеет нуклеотижный состав, отличающийся от основной массы ДНК и выделяется в отдельную фракцию – ее назвали сателлитной фракцией. Участки ДНК с таким повторами выявлены в определенных местах хромосом: это околоцентромерные и теломерные районы. На дифференцированно окрашенных хромосомах они выявляются в виде гетерохроматина. Причем это гетерохроматин конститутивный – в нем не происходит транскрипция

• Размер гаплоидного генома человека оценивают в 3 х109 н. п. (по данным Шевченко 7, 1 х 109 н. п. ) • Примерно 30% генома составляют повторяющиеся последовательности с разной степенью повторяемости. • Фракция высокоповторяющейся ДНК (106 копий) составляет примерно 8 – 12% всей ДНК. Часть таких повторов имеет нуклеотижный состав, отличающийся от основной массы ДНК и выделяется в отдельную фракцию – ее назвали сателлитной фракцией. Участки ДНК с таким повторами выявлены в определенных местах хромосом: это околоцентромерные и теломерные районы. На дифференцированно окрашенных хромосомах они выявляются в виде гетерохроматина. Причем это гетерохроматин конститутивный – в нем не происходит транскрипция

• Размер гаплоидного генома человека оценивают в 3 х109 н. п. (по данным Шевченко 7, 1 х 109 н. п. ) • Примерно 30% генома составляют повторяющиеся последовательности с разной степенью повторяемости. • Фракция высокоповторяющейся ДНК (106 копий) составляет примерно 8 – 12% всей ДНК. Часть таких повторов имеет нуклеотижный состав, отличающийся от основной массы ДНК и выделяется в отдельную фракцию – ее назвали сателлитной фракцией. Участки ДНК с таким повторами выявлены в определенных местах хромосом: это околоцентромерные и теломерные районы. На дифференцированно окрашенных хромосомах они выявляются в виде гетерохроматина. Причем это гетерохроматин конститутивный – в нем не происходит транскрипция

• Кроме высокоповторяющейся у человека примерно 12, 5% генома составляет гетерогенная фракция умеренно повторяющихся последовательностей (10 – 105 копий на геном). Часть умеренных повторов образована в виде множественных сгруппированных генов (рибосомные гены, гены т. РНК и др. ) Число повторов генов рибосомных РНК (28 S, 18 S и 5, 8 S) до 160 копий (по последним данным до 416 443 копий на диплоидный геном, Шевченко, с56). Гены рибосомной РНК являются частью района ядрышкового организатора на хромосомах. У человека район ядрышкового организатора расположен в коротких плечах акроцентрических хромосом: 13 й, 14 й, 15 й, 21 й и 22 й. В формировании ядрышка могут принимать участие сразу несколько хромосом. Общее число генов т. РНК достигает 100 копий.

• Другая часть умеренных повторов рассеяна по всему геному (Alu, Kpn 1). Наиболее изучены в этой фракции сем. Аlu. Составляет в геноме примерно 3%. Длина – 300 н. п. и 5 х 105 копий. Распространены по всему геному. Имеют сайт узнавания для рестриктазы Alu 1, отсюда и название. Alu последовательности в геноме фланкированы короткими прямыми повторами, что характерно для мобильных элементов. О функциональной роли Alu повторов пока ничего не известно. • Кроме Alu, в геноме человека выявлено еще одно семейство – Kpn 1 (их можно получить из генома человека с помощью рестриктазы Kpn 1). Число копий Kpn 1 примерно 104. Мобильные элементы Kpn 1 и Alu включены в группу ретропозонов. • К умеренным повторам относят также некоторые гены, кодирующие белки, например, актиновые гены – 20 -30 копий, а также семейство многочисленных генов вариабельных участков иммуноглобулинов, играющих ключевую роль в иммунитете.

• Уникальные гены – большинство генов, кодирующих белок. К 1985 г. выделено 249 генов человека, колирующих белки. Среди них наиболее полно изучена система глобиновых генов. К 1989 г. выделено и изучено около 1000 генов. В настоящее время известна структура около 7 тысяч генов, сюда входят кроме структурных генов, гены регуляторные – энхансеры, сайленсеры, гены, контролирующие процессинг м. РНК и т. п. • • Число всех генов ранее оценивали в 100 000, в настоящее время 30 000. •