Культуры клеток в вирусологии: теория и

Культуры клеток в вирусологии: теория и практика Выполнила студентка 3 курса факультета ветеринарной медицины Устинова Варвара Андреевна Научные руководители: доцент кафедры зоологии, экологии и охраны природы имени А. Г. Банникова, к. б. н. , Тыньо Ярославович профессор кафедры радиобиологии и вирусологии имени академиков А. Д. Белова и В. Н. Сюрина, д. б. н. , Ярыгина Елена Игоревна Москва-2016

Живые системы в вирусологии Живая система – совокупность живых клеток, чувствительных для вируса Естественно- Лабораторные Куриные Культуры клеток восприимчивые животные (ЛЖ) эмбрионы (КЭ) (КК) животные (ЕВЖ)

Культура клеток – клетки многоклеточного организма, живущие и размножающиеся в лабораторных условиях – in vitro

Классификация клеточных культур КК по продолжительности жизнеспособности Переживающая КК Растущая КК (клетки не делятся) (делящиеся клетки) КК, фиксированная Собственно на кусочке ткани культура клеток

Классификация клеточных культур КК по способу культивирования Однослойная Суспензионная (стационарная)

Монослойные культуры клеток Первично- трипсинизированная культура (1 -2 пассажа) Субкультура (5 -10 пассажей) Диплоидная культура (50± 20 пассажей) Перевиваемая культура (неограниченное число пассажей)

Первично- Свойства КК трипсинизированная Диплоидная КК Перевиваемая КК КК, субкультура Из первично- Происхождение Из органа/ткани трипсинизированной Из диплоидной КК КК Продолжительность Неограниченное 1 -5 50± 20 жизни, пассажей число пассажей Кариотип (набор Диплоидный Гетероплоидный хромосом) Туморогенность (онкогенность) - + В основном Чаще – Тип клеток Смешанный фибробластоподобные эпителиоподобные клетки

Жизненный цикл культуры клеток

Образование Индикация бляшек на монослое вирусов Цитопатическое действие: Признаки округление, размножения фрагментация, Цветная образование проба вируса в КК симпластов Гемадсорбция

Цитопатическое действие – любые изменения монослоя клеток в результате воздействия на него вируса Культура клеток КСТ, (коронарные сосуды теленка) пораженная вирусом ПГ-3

Задачи вирусологии, решаемые с помощью КК: 1. Индикация (обнаружение) вируса по ЦПД 2. Накопление вируса 3. Изоляция вируса 4. Титрование вируса по ЦПД 5. Поддержание вируса 6. Освежение штаммов после длительного хранения 7. Изучение размера, формы фокусов ЦПД вируса 8. Изготовление культуральных вакцин 9. Изучение свойств вновь выделенных вирусов

Культуры клеток • Отсутствие этических • Клеточные взаимодействия проблем при постановке in vitro отличаются от опыта таковых в живом • Экономичность организме, что затрудняет • Возможность правильную интерпретацию моделирования различных полученных результатов ситуаций в ходе • Высокий риск эксперимента контаминации (заражения • Получение однозначных посторонними сопоставимых результатов микроорганизмами) при соблюдении условий клеточной культуры при культивирования несоблюдении правил • Возможность изучения работы процессов на клеточном уровне

Работа с однослойными культурами клеток

Культуральная посуда

Питательные среды Естественного Искусственные происхождения Синтетические Полусинтетические Экстракты из органов и Естественные Раствор пит. среды + тканей на Хенкса, растворе соли + цветной раствор Эрла индикатор Хенкса

Питательные среды Диспергирующие Поддерживающие (снятие клеток со стекла) Поддерживающие Ростовые 1. р-р Версена (0, 002%) 5 -10% 2. р-р трипсина 0 -2% сыворотки (0, 25%) сыворотки крови КРС – крови КРС ростовой 3. р-р ЭДТА фактор 4. химотрипсин

Техника безопасности Требования: 1. НЕ распространяй! 2. НЕ контаминируй! (не загрязняй!) 3. НЕ заразись!

Правила работы: 1. На рабочем месте меньше говорить, быть собранным, аккуратным, внимательным 2. С вирусом работать в боксе 3. Работать в спецодежде (халат, чепчик, сменная обувь, стерильные перчатки, маска, комбинезон) 4. В боксе с вирусом работать в самой стерильной зоне – у пламени горелки (на расстоянии 15 -20 см) 5. Пользоваться только стерильными расходными материалами (посуда, дозаторы, инструментарий, тампоны) 6. Нельзя допускать образования мелкодисперсных аэрозолей 7. Нельзя ничего брать в рот, есть, пить, курить

После работы необходимо: 1. Инактивировать все расходники (собрать в место дезинфекции) 2. Обработать рабочие поверхности дезинфицирующим раствором (аламинол) 3. Обработать воздух УФЛ 4. Обработать руки (перчатки – в место дезинфекции, вымыть руки с щелочным хозяйственным мылом) 5. Снять спецодежду.

Пассаж культуры клеток

I Подготовка рабочего места 1. Обработать поверхности спиртом 2. Обработатьбокс УФЛ в течение 15 минут, одновременно обработать воздух помещения рециркулятором воздуха «Дезар» 3. Нагретьв термостате или на водяной бане раствор Версена (до 37°С)

II Отделение клеток от монослоя 1. Включить газ 2. Надеть перчатки и маску, обработать руки и рабочую поверхность спиртом 3. Открыть матрас 4. Слить культуральную среду в жидкие отходы 5. Открыть раствор Версена 6. Налить небольшое количество р-ра Версена в матрас 7. Закрыть матрас и раствор Версена 8. Несильными покачиваниями распределить р-р по монослою 9. Открыть матрас 10. Слить р-р Версена

II Отделение клеток от монослоя 11. Повторить пункты 5 -10 2 раза 12. В последний раз оставить 1 мл (примерно, правило уголка) р-р Версена в матрасе 13. Закрыть матрас 14. Оставить матрас в термостате на 5 -10 минут 15. Подготовить рабочее поле, убрать р-р Версена в холодильник, включить УФЛ, выйти из бокса

III Контроль отделения монослоя 1. Просмотреть дно матраса на свет, оценить отхождение монослоя 2. Аккуратнопотрясти матрас, постукивая боковой гранью об ладонь 3. Принеобходимости оставить матрас в термостате еще на несколько минут

IV Обновление КК (собственно пассаж) 1. Обработать рабочее поле, питательную смесь, матрасы спиртом 2. Достать из холодильника сыворотку крови КРС 3. Открыть емкость с пит. смесью 4. Открыть матрас 5. Налить в матрас пит. смесь до нужного объема (15/20 мл) 6. Закрыть матрас и пит. смесь 7. Аккуратно перемешать содержимое матраса 8. Открыть матрас 9. Разлить клеточную суспензию на нужное количество матрасов/ слить часть суспензии в жидкие отходы 10. Довести объем пит. среды в каждом матрасе до 15 мл

IV Обновление КК (собственно пассаж) 11. Снять фольгу с флакона с сывороткой крови КРС 12. С помощью пинцета извлечь пробку (в 2 этапа, с фламбированием), поместить пробку в емкость со спиртом 13. Открыть матрас 14. Поместить в матрас 1, 5 мл сыворотки крови КРС (10% от объема пит. среды) 15. Закрыть матрас 16. Взять пинцетом пробку из емкости со спиртом 17. Профламбировать пробку над пламенем горелки 18. Плотно закрыть флакон с сыв-кой кр. КРС пробкой, затем фольгой 19. Проконтролировать плотное закрытие всех матрасов и емкостей

V Уборка рабочего места 1. Подписать на матрасах дату и номер пассажа 2. Поместить матрасы в термостат 3. Убрать сыворотки крови КРС в холодильник 4. Протереть все поверхности спиртом 5. Очиститьемкости с сухими (выкинуть в мусорный пакет) и жидкими (если нет вируссодержащего материала – вылить в раковину) отходами, в емкость для жидких отходов залить небольшое количество 5% р-ра аламинола 6. Включить УФЛ и рециркулятор на 15 минут

Благодарю за внимание!