Скачать презентацию КУЛЬТУРА КЛЕТОК И ТКАНЕЙ – альтернативный источник получения Скачать презентацию КУЛЬТУРА КЛЕТОК И ТКАНЕЙ – альтернативный источник получения

Культивирование клеток.ppt

  • Количество слайдов: 67

КУЛЬТУРА КЛЕТОК И ТКАНЕЙ – альтернативный источник получения биологически активных веществ из растений КУЛЬТУРА КЛЕТОК И ТКАНЕЙ – альтернативный источник получения биологически активных веществ из растений

1. Преимущества культивируемых растительных клеток в качестве источников биологически активных веществ 2. Особенности вторичного 1. Преимущества культивируемых растительных клеток в качестве источников биологически активных веществ 2. Особенности вторичного метаболизма в культуре растительных клеток и тканей 3. Регуляция синтеза вторичных метаболитов. Способы повышения выхода целевых продуктов 4. Системы культивирования клеток для получения вторичных метаболитов 5. Этапы разработки промышленных технологий получения биологически активных веществ с помощью культивируемых растительных клеток

Термин «культура клеток, тканей и органов» применяется к следующим асептически выращиваемым частям растения: Культура Термин «культура клеток, тканей и органов» применяется к следующим асептически выращиваемым частям растения: Культура клеток, тканей и органов растений Изолированные зародыши Изолированные органы Каллусная культура Культура протопластов Суспензионная культура

Каллусная культура Каллусная культура

Суспензионная культура Суспензионная культура

ПРИНЦИПЫ МЕТОДА: 1) соблюдение условий асептики; 2) использование специальных питательных сред ПРИНЦИПЫ МЕТОДА: 1) соблюдение условий асептики; 2) использование специальных питательных сред

СОБЛЮДЕНИЕ УСЛОВИЙ АСЕПТИКИ Стерилизации должны подвергаться qоперационная комната, в которой производят изоляцию и посадку СОБЛЮДЕНИЕ УСЛОВИЙ АСЕПТИКИ Стерилизации должны подвергаться qоперационная комната, в которой производят изоляцию и посадку культур; qодежда и руки работающего персонала; qпосуда, используемая для культивирования объектов; qвсе необходимые инструменты и материалы; q питательные среды; q объекты культивирования

Компоненты питательных сред для выращивания растительных объектов in vitro можно разделить на 5 групп: Компоненты питательных сред для выращивания растительных объектов in vitro можно разделить на 5 групп: qмакроэлементы; qмикроэлементы; qисточники углерода; qвитамины; qрегуляторы роста.

Минеральная основа питательных сред Макроэлементы Элемент N Р S Fe K Mg Ca Источник Минеральная основа питательных сред Макроэлементы Элемент N Р S Fe K Mg Ca Источник NO 3 -, NH 4+, аминокислоты, гидролизат казеина PO 43 -, фосфаты сахаров SO 42 -, SO 32 -, цистеин, глутатион, метионин Fe. CI 3, Fe 2(SO 4)3, лимоннокислое железо КCI, KNO 3, KH 2 PO 4 Mg. SO 4 x 7 Н 2 О Ca(NO 3)2, Ca. CI 2 Микроэлементы Элемент Mn Cu Zn Co Mo B CI Источник Mn. SO 4 x. H 2 O Cu. SO 4 x 5 H 2 O Zn. SO 4 x 4 H 2 O Co. CI 2 Na 2 Mo. O 4 H 3 BO 4 KCI

Источник углерода: сахароза (2 -3 глюкоза, фруктоза, крахмал (редко) %), Витамины: тиамин, рибофлавин, биотин, Источник углерода: сахароза (2 -3 глюкоза, фруктоза, крахмал (редко) %), Витамины: тиамин, рибофлавин, биотин, пантотеновая кислота, пиридоксин, аскорбиновая кислота Регуляторы роста: ауксины (2, 4 -Д, НУК, ИУК) и цитокинины (кинетин, БАП, зеатин)

Клеточные технологии для получения Биологически активные вещества экономически важных веществ растений, как правило, относятся Клеточные технологии для получения Биологически активные вещества экономически важных веществ растений, как правило, относятся к растительного происхождения вторичным метаболитам

Первичный метаболизм Функции Вторичный метаболизм Обеспечение процессов роста и биохимической развития адаптации растений к Первичный метаболизм Функции Вторичный метаболизм Обеспечение процессов роста и биохимической развития адаптации растений к существованию в биоценозах Характеристики Универсальность Однотипность Консервативность Совершенно необходим для роста и развития Специфичность Разнообразие реакций Адаптивный характер Необязателен для роста и развития

Как альтернативные источники БАВ культуры растительных клеток и тканей обладают следующими преимуществами: ● получение Как альтернативные источники БАВ культуры растительных клеток и тканей обладают следующими преимуществами: ● получение экологически чистых продуктов независимо от климата, сезона, погоды; ● создание клеточных линийсверхпродуцентов;

Сравнение биосинтетического потенциала отдельных каллусных (К), суспензионных культур (С) и интактных растений Растение Вторичные Сравнение биосинтетического потенциала отдельных каллусных (К), суспензионных культур (С) и интактных растений Растение Вторичные метаболиты (ВМ) Тип культ уры Сод-е ВМ, % сух. в. (культура) А Сод-е ВМ, % сух. в. (растение) В Отношение А/В Сatharanthus roseus Аймалицин С 1, 3 0, 26 5, 0 Galium aparine Антрахинон С 3, 8 -5, 7 0, 28 13, 5 -20, 0 Dioscorea deltoides Диосгенин С 7, 8 2 3, 9 Panax ginseng Тритерпеновые гликозиды К 27 4, 5 6, 0 Nicotiana tabacum Убихинон-10 С 0, 19 0, 003 63, 0

Как альтернативные источники БАВ культуры растительных клеток и тканей обладают следующими преимуществами: ● получение Как альтернативные источники БАВ культуры растительных клеток и тканей обладают следующими преимуществами: ● получение экологически чистых продуктов независимо от климата, сезона, погоды; ● создание клеточных линий-сверхпродуцентов; ● сохранение пула генов редких и исчезающих растений-продуцентов; ● экономия площадей; ● возможность оптимизировать и стандартизировать условия выращивания; ● возможность автоматизации процессов.

Клеточные технологии для получения экономически важных веществ Применение культуры клеток растений для растительного происхождения Клеточные технологии для получения экономически важных веществ Применение культуры клеток растений для растительного происхождения получения экономически важных продуктов Традиционные растительные продукты Алкалоиды Стероиды Терпены и терпеноиды Гликозиды Полифенолы Полисахариды Эфирные масла Натуральные красители Вкусовые добавки Инсектициды Продукты биотрансформации Новые активные вещества Ингибиторы фитовирусов Антиканцерогены Ингибиторы протеаз Убихинон Q 10 Необычные белки Метилдигоксин Дигоксин Ментол Неоментол Гераниол

Клеточныерастения, культурыдля получения технологии клеток которых Некоторые используются для получения вторичных метаболитов экономически важных Клеточныерастения, культурыдля получения технологии клеток которых Некоторые используются для получения вторичных метаболитов экономически важных веществ Лекарственное Активность растительного происхождения вещество Растение источник Женьшень настоящий Тритерпеновые (Panax ginensis) гликозиды Тонизирующие, стимулирующие, адаптогенные свойства Диоскорея дельтовидная Диосгенин Гормональные и противозачаточные свойства Дигоксин Сердечно-сосудистое средство Резерпин Гипотензивное средство Кодеин Болеутоляющее средство Атропин Антихолинэргические свойства (Dioscorea deltoidea) Наперстянка пурпурная (Digitalis purpurea) Раувольфия змеиная (Rauwolfia serpentina) Мак снотворный (Papaver somniferum) Беладонна (Atropa belladonna)

Диоскорея дельтовидная (Dioscorea deltoidea) Диосгенин Гормональные и противозачаточные свойства Диоскорея дельтовидная (Dioscorea deltoidea) Диосгенин Гормональные и противозачаточные свойства

Наперстянка пурпурная (Digitalis purpurea) Дигитоксин Сердечнососудистое средство Наперстянка пурпурная (Digitalis purpurea) Дигитоксин Сердечнососудистое средство

Раувольфия змеиная (Rauwolfia serpentina) Резерпин Аймалицин Гипотензивное средство Раувольфия змеиная (Rauwolfia serpentina) Резерпин Аймалицин Гипотензивное средство

Мак снотворный (Papaver somniferum) Кодеин Морфин Болеутоляющее средство Мак снотворный (Papaver somniferum) Кодеин Морфин Болеутоляющее средство

Беладонна (Atropa belladonna) Атропин Atropa belladonna Антихолинэргические свойства Беладонна (Atropa belladonna) Атропин Atropa belladonna Антихолинэргические свойства

Ландыш майский (Convallaria majalis) Сердечные гликозиды Тонизирующие сердечную деятельность Ландыш майский (Convallaria majalis) Сердечные гликозиды Тонизирующие сердечную деятельность

В настоящее время наиболее перспективно использование культур клеток растений для получения: -противоопухолевых препаратов типа В настоящее время наиболее перспективно использование культур клеток растений для получения: -противоопухолевых препаратов типа таксола, камптотецина; -антивирусных препаратов, особенно анти. ВИЧ; -адаптогенных и стимулирующих препаратов; -терпеноидных гликозидов с широким спектром активности – от подсластителей до иммуностимуляторов.

Клеточные технологии метаболизма для получения Особенности вторичного экономически важных веществ растительных клеток в культуре Клеточные технологии метаболизма для получения Особенности вторичного экономически важных веществ растительных клеток в культуре in vitro Клетки растительного происхождения in vivo in vitro Признак Стабильность синтеза вторичных метаболитов Как правило, стабильны Возможны различные варианты Локализация процессов синтеза, транспорта и накопления вторичных метаболитов В большинстве случаев разведены по отдельным органам Осуществляются в одной клетке Вторичный метаболизм – особенность Возможны различные варианты Связь процесса вторичного метаболизма с

Клеточные технологии для получения В зависимости от степени стабильности экономически важных веществ синтеза вторичных Клеточные технологии для получения В зависимости от степени стабильности экономически важных веществ синтеза вторичных метаболитов растительного происхождения выделяют: §стабильные популяции, в которых синтез осуществляется на постоянном уровне длительного времени; метаболитов в течение §популяции клеток, для которых с течением времени происходит постепенное снижение уровня синтеза метаболитов; §“нестабильные” популяции, характеризующиеся быстрой утратой способности к синтезу вторичных метаболитов. Причина – прекращение экспрессии генов, отвечающих за образование вторичных метаболитов.

Локализация процессов синтеза и накопления вторичных метаболитов Внутриклеточные метаболиты Синтез Накопление АЛКАЛОИДЫ Пластиды, цитоплазма Локализация процессов синтеза и накопления вторичных метаболитов Внутриклеточные метаболиты Синтез Накопление АЛКАЛОИДЫ Пластиды, цитоплазма ТЕРПЕНОИДЫ Монотерпены Тритерпены Лейкопласты СП Хлоропласты, лейкопласты Вакуоль, СП, цитоплазма ФЕНОЛЫ Флавоноиды Танины Кумарины Оксикоричные кислоты Вакуоль, хлоропласты, СП Хлоропласты Вакуоль, пластиды, ЭПР, хлоропласты митохондрии СП, вакуоли, хлоропласты Вакуоль, СП, ЭПР Вакуоль, СП, хлоропласты ЦИАНОГЕННЫЕ ГЛИКОЗИДЫ ЭПР Вакуоль БЕТАИНЫ Цитоплазма Вакуоль

Связь процесса вторичного метаболизма с дифференцировкой Взаимосвязь между продукцией алкалоидов и дифференцировкой в культуре Связь процесса вторичного метаболизма с дифференцировкой Взаимосвязь между продукцией алкалоидов и дифференцировкой в культуре Datura meteloides Объект Каллус Стеблевые побеги, формируемые в каллусе Стеблевые побеги, формирующие корни Лист молодого растения Лист взрослого растения Содержание алкалоидов (% сух. в. ) 1 x 10 -2 1. 5 x 10 -2 3 x 10 -2 1 x 10 -1

Связь накопления вторичных метаболитов с ростом клеток Стационарная фаза Параметр роста Антоцианы Некоторые фенольные Связь накопления вторичных метаболитов с ростом клеток Стационарная фаза Параметр роста Антоцианы Некоторые фенольные соед-я Сесквитерпены Антрахиноны Серпентин Никотин Бетацианин Берберин Диосгенин Сангвинарин Лог-фаза Хлорогеновая кислота Шиконин Виснагин Лаг-фаза t, дни

Клеточные технологии для получения СПОСОБЫ ПОВЫШЕНИЯ ПРОДУКЦИИ экономически важных веществ ВТОРИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ растительного происхождения Клеточные технологии для получения СПОСОБЫ ПОВЫШЕНИЯ ПРОДУКЦИИ экономически важных веществ ВТОРИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ растительного происхождения 1. Отбор высокопродуктивных растений для введения в культуру 2. Оптимизация условий культивирования 2. 1. Состав питательной среды 2. 2. Физические условия 3. Внесение в среду предшественников вторичных метаболитов 4. Обработка элиситорами 5. Использование иммобилизованных клеток 6. Мутагенез и клеточная селекция

1. Отбор высокопродуктивных растений для введения в культуру Как правило, высокий выход продукта дают 1. Отбор высокопродуктивных растений для введения в культуру Как правило, высокий выход продукта дают культуры, инициированные из высокопродуктивных растений Немаловажное значение также имеет выбор органа растения при введении в культуру. Ex. Содержание стероида диосгенина в культуре клеток диоскореи, полученной из клубня, было на порядок выше, чем в культуре клеток, полученной из побега.

Клеточные технологии для получения экономически важных веществ 2. 1. Оптимизация состава питательной среды растительного Клеточные технологии для получения экономически важных веществ 2. 1. Оптимизация состава питательной среды растительного происхождения Влияние типа питательных сред на рост и продукцию серпентина суспензионной культурой Catharanthus roseus Питательная среда Гамборга-B 5+1 мг/л 2, 4 -Д Гамборга-B 5+2 мг/л НУК Гамборга-В 5 Линсмайера и Скуга Мурасиге и Скуга Ничей Уайта Прирост биомассы клеток Сод-е серпентина, % сух. в. 4. 6 5. 2 7. 6 5. 1 9. 3 8. 9 2. 3 0. 8 0. 01 0 0. 02 0 0 0. 12 0. 09 0

Клеточные технологии для получения экономически важных веществ КОМПОНЕНТЫ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД, эффективно регулирующие синтез вторичных Клеточные технологии для получения экономически важных веществ КОМПОНЕНТЫ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД, эффективно регулирующие синтез вторичных метаболитов в культурах растительных клеток растительного происхождения Фитогормоны Углеводы Макроэлементы (азот, фосфор)

Клеточные технологии для получения Регуляция образования вторичных экономически важных веществ метаболитов с помощью фитогормонов: Клеточные технологии для получения Регуляция образования вторичных экономически важных веществ метаболитов с помощью фитогормонов: растительного происхождения Действие фитогормонов специфично (зависит от вида растения, природы вторичного соединения, клеточного штамма и т. д. ). Снижение уровня ауксинов в питательной среде, в первую очередь 2, 4 -Д, в большинстве случаев приводит к повышению продукции вторичных метаболитов. Варьируя концентрации ауксинов и цитокининов, можно оказать значительное влияние на процессы синтеза каждой конкретной культурой искомого вещества.

Возможные механизмы влияния фитогормонов на синтез вторичных метаболитов: 1) Модификация активности ферментов Фитогормон НУК Возможные механизмы влияния фитогормонов на синтез вторичных метаболитов: 1) Модификация активности ферментов Фитогормон НУК 2, 4 -Д Повышение активности ферментов Никотиндеметилаза Ингибирование активности ферментов Триптофандекарбоксилаза Фенилаланинаммиаклиаза (ФАЛ) Кумаратлигаза Халконсинтаза 2) Регуляция транскрипции генов, ответственных за синтез вторичных метаболитов

Клеточные технологии для получения Регуляция образования вторичных метаболитов экономически важных веществ с помощью углеводов: Клеточные технологии для получения Регуляция образования вторичных метаболитов экономически важных веществ с помощью углеводов: растительного происхождения в Увеличение концентрации сахарозы питательной среде приводит к повышению выхода вторичных метаболитов Влияние концентрации сахарозы в питательной среде на рост и продукцию серпентина суспензионной культурой Catharanthus roseus

Механизмы влияния сахарозы на образование вторичных метаболитов: 1) увеличение продолжительности стационарной фазы ростового цикла; Механизмы влияния сахарозы на образование вторичных метаболитов: 1) увеличение продолжительности стационарной фазы ростового цикла; 2) ингибирование синтеза эндогенных ауксинов; 3) увеличение активности ферментов пентозофосфатного пути.

Клеточные технологии для получения Регуляция образования вторичных метаболитов экономически важных веществ с помощью макроэлементов: Клеточные технологии для получения Регуляция образования вторичных метаболитов экономически важных веществ с помощью макроэлементов: растительного происхождения Дефицит азота в питательной среде во многих случаях приводит к повышению выхода вторичных метаболитов Влияние концентрации нитрата в питательной среде на образование капсаицина клетками Capsicum frutescens Концентрация NO 3(ммоль/л) Содержание капсаицина, мкг/г сух. в. 0 484 5 375 10 166 25 178 50 111 Дефицит фосфора в питательной среде либо полное его исключение стимулирует синтез вторичных метаболитов

Возможные механизмы влияния дефицита азота и фосфора на синтез вторичных метаболитов: 1) замедление ростовых Возможные механизмы влияния дефицита азота и фосфора на синтез вторичных метаболитов: 1) замедление ростовых процессов; 2) изменение активности ферментов (триптофандекарбоксилаза, фенилаланинаммиаклиазапримеры ферментов, активность которых регулируется внутриклеточной концентрацией фосфора); 3) недостаток азота вызывает накопление углеводов, которые используются для синтеза антоцианов и др. продуктов вторичного обмена.

Влияние р. Н питательных сред Изменение р. Н питательной среды в процессе культивирования сказывается Влияние р. Н питательных сред Изменение р. Н питательной среды в процессе культивирования сказывается на биосинтетических свойствах и способности к накоплению продукта культивируемых клеток Ex. В культуре клеток Ipomea, которые биотрансформируют триптофан в различные индольные метаболиты, выход триптанола увеличивается вдвое при р. Н 6, 3. Когда р. Н падает до 4, 8 накопление триптанола полностью подавляется.

Клеточные технологии для получения экономически важных веществ растительного происхождения Оптимизация питательной среды является ключевым Клеточные технологии для получения экономически важных веществ растительного происхождения Оптимизация питательной среды является ключевым моментом в повышении выхода продукта. Результатом подобных исследований являются так называемые продукционные среды, на которых культивируемые клетки синтезируют значительные количества вторичных метаболитов.

Клеточные технологии для получения экономически важных веществ 2. 2. Оптимизация физических параметров растительного происхождения Клеточные технологии для получения экономически важных веществ 2. 2. Оптимизация физических параметров растительного происхождения Физические условия культивирования, регулирующие синтез вторичных метаболитов в культурах растительных клеток Свет Температура Аэрация

Клеточные технологии для получения ЗАВИСИТ ОТ: экономически важных веществ интенсивности освещения длины волны продолжительности Клеточные технологии для получения ЗАВИСИТ ОТ: экономически важных веществ интенсивности освещения длины волны продолжительности освещения растительного происхождения ХАРАКТЕР ВЛИЯНИЯ СВЕТА НА ОБРАЗОВАНИЕ ВТОРИЧНЫХ МЕТАБОЛИТОВ В КУЛЬТУРАХ РАСТИТЕЛЬНЫХ КЛЕТОК СТИМУЛЯЦИЯ образования каротиноидов, эфирных масел, коричных масел, флавоноидов, пластохинонов, антоцианов, катехинов, витаминов ПОДАВЛЕНИЕ синтеза алкалоидов в культурах клеток дурмана, скополии, табака, хинного дерева, воробейника

Влияние света на биосинтез вторичных метаболитов осуществляется двумя путями: через образование углеводов и энергии Влияние света на биосинтез вторичных метаболитов осуществляется двумя путями: через образование углеводов и энергии в процессе фотосинтеза; через активность фитохромной системы.

Клеточные технологии для получения Влияние температуры на биосинтез экономически важных веществ вторичных метаболитов растительного Клеточные технологии для получения Влияние температуры на биосинтез экономически важных веществ вторичных метаболитов растительного происхождения Температурные оптимумы для роста культуры клеток и биосинтеза вторичных метаболитов не всегда совпадают Температурные сдвиги в процессе культивирования могут приводить к изменениям не только количества продуцируемых вторичных метаболитов, но также и их качественного состава Низкие температуры, как правило, способствуют ослаблению ингибирующего влияния 2, 4 -Д на образование вторичных метаболитов

Клеточные технологии для получения Влияние аэрации на важных веществ экономически образование вторичных метаболитов растительного Клеточные технологии для получения Влияние аэрации на важных веществ экономически образование вторичных метаболитов растительного происхождения Хорошие условия аэрации особенно важны для суспензионных культур Ex. У клеток табака увеличение скорости перемешивания увеличивало выход никотина

Клеточные технологии для получения 3. Добавление в среду предшественников экономически важных веществ вторичных метаболитов Клеточные технологии для получения 3. Добавление в среду предшественников экономически важных веществ вторичных метаболитов растительного происхождения Позволяет усилить биосинтез и накопление вторичных метаболитов Влияние предшественников алкалоидов на увеличение биомассы и продукцию алкалоидов суспензионной культурой Catharantus roseus Предшественники Контроль Индольные соединения Шикимовая кислота Индол Триптамин L-Триптофан D-Триптофан Конц-я предшест. (мг/л) Прирост биомассы, % Сод-е алкалоидов, % 0 100 50 50 100 500 110 75 175 65 122 98 67 284 55

Клеточные технологии для получения Причины отсутствия желаемого эффекта: экономически важных веществ Øпредшественники клетками; растительного Клеточные технологии для получения Причины отсутствия желаемого эффекта: экономически важных веществ Øпредшественники клетками; растительного не поглощаются происхождения Øони распадаются в процессе приготовления и стерилизации среды или переходят в другие физиологически неактивные формы; Øмогут ингибировать рост культуры. Главное препятствие в выяснении этих причин – недостаточное знание путей биосинтеза многих продуктов вторичного метаболизма.

Клеточные технологии для получения экономически важных веществ 4. Обработка элиситорами растительного впроисхождения Элиситоры – Клеточные технологии для получения экономически важных веществ 4. Обработка элиситорами растительного впроисхождения Элиситоры – соединения, образующиеся результате жизнедеятельности патогенов (экзометаболиты). К ним относятся пептиды, липиды и полисахаридные фрагменты клеточных стенок патогена Связывание элиситоров с соответствующими рецепторами запускает реакцию сверхчувствительности Развитие СВЧ сопровождается синтезом фитоалексинов и других зашитных соединений Фитоалексины – индуцибельные защитные соединения, токсичные как для патогена, так и для растительной клетки. По химической природе - различные группы вторичных метаболитов

Клеточные технологии для получения экономически важных веществ ЭЛИСИТОРЫ растительного происхождения биотические Полисахариды (глюканы, хитозан) Клеточные технологии для получения экономически важных веществ ЭЛИСИТОРЫ растительного происхождения биотические Полисахариды (глюканы, хитозан) Пептиды (поли-L-лизин, полиамины, гликопротеины) Ферменты (полигалактуроназа, целлюлаза) Жирные кислоты (арахидоновая кислота) Ионы металлов (Al 3+, Zn 2+, Cu 2+) «абиотические» УФ-свет Дополнит. компоненты питательных сред (агароза и др. ) Тяжелые металлы (Cd 2+, Pb 2, Ni 2, Cr 3+) Детергенты Фунгициды (беномил, бутиламин) Гербициды (ацифлуорофен) ! Переход клеток растений к биосинтезу ВМ является стереотипным ответом на стресс, независимо от фактора , которым он вызывается

Клеточные технологии для получения Примеры увеличения синтеза вторичных метаболитов, экономически важных под действием продуцируемых Клеточные технологии для получения Примеры увеличения синтеза вторичных метаболитов, экономически важных под действием продуцируемых клеточными культурам, веществ элиситоров растительного происхождения Растение Вторичные метаболиты Концентрация (мг/г сух. в. ) Контроль Воздействие элиситора Продолжитель ность инкубации (ч) Сinchona ledgeriana Антрахиноны 3 15 600 Dioscorea deltoides 25 72 72 0, 07 1, 4 - Диосгенин Papaver somniferum Морфин Phaseolus vulgaris Фазеолин 0 170 48 Thalictrum rugosum Берберин 20 50 96

Клеточные технологии для получения 5. Использование иммобилизованных клеток экономически важных веществ Суть метода - Клеточные технологии для получения 5. Использование иммобилизованных клеток экономически важных веществ Суть метода - заключение живых клеток в определенный носитель, который помещают в питательную среду. При этом клетки прекращают рост, но могут достаточно долго оставаться живыми и продуцировать необходимые вещества, выделяя их в среду. растительного происхождения Примеры увеличения продукции вторичных метаболитов под действием иммобилизации Вид растения Матрикс Вторичный метаболит Увеличение продукции ВМ Morinda citrifolia Альгинат Антрахиноны × 10 Capsicum frutescens Полиуретан Капсаицин × 50 Catharanthus roseus Альгинат Аймалицин, серпентин × 2, 5 Datura innoxia Альгинат Скополамин, атропин × 10

Клеточные технологии для получения ПРЕИМУЩЕСТВА важных веществ экономически. ИММОБИЛИЗАЦИИ: 1) приводит к снижению скорости Клеточные технологии для получения ПРЕИМУЩЕСТВА важных веществ экономически. ИММОБИЛИЗАЦИИ: 1) приводит к снижению скорости клеточных делений и скорости роста, что способствует более высокому выходу продукта; 4) обеспечивает гораздо более легкое управление химическим составом окружающей среды; растительного происхождения 2) вызывает увеличению числа межклеточных контактов, что обеспечивает более эффективное использование кофакторов, играющих существенную роль в клеточном метаболизме; 3) агрегированность клеток, обусловленная иммобилизацией, вызывает формирование в гранулах физических и химических градиентов, что оказывает положительное воздействие на экспрессию путей синтеза вторичных метаболитов; 5) упрощает осуществление химических воздействий, необходимых для высвобождения синтезированных продуктов; 6) делает возможным многократное использование биомассы путем сохранения клеток в биореакторе и выделения продукта из среды; 7) позволяет осуществлять эффективную биотрансформации веществ.

Примеры реакций биотрансформации, осуществляемых с помощью иммобилизованных растительных клеток Наперстянка шерстистая Digitalis lanata Альгинат Примеры реакций биотрансформации, осуществляемых с помощью иммобилизованных растительных клеток Наперстянка шерстистая Digitalis lanata Альгинат Метилдигитоксин метилдигоксин Мак снотворный Papaver somniferum Альгинат Кодеинон кодеин Катаранус розовый Catharanthus roseus Агароза Катенамин аймалицин Основное ограничение в применении метода – необходимость использования клеток, которые способны секретировать синтезируемые метаболиты в окружающую среду или могут быть индуцированы к такой секреции какими-либо приемами

Клеточные технологии для получения экономически важных веществ 6. Мутагенез и клеточная селекция растительного происхождения Клеточные технологии для получения экономически важных веществ 6. Мутагенез и клеточная селекция растительного происхождения Примеры мутагенов, используемых в работе с культурами растительных клеток и тканей: этилметансульфонат, N-этил-N-нитрозомочевина, N-метил-N-нитро-Nнитрозогуанидин, N-нитрозометилмочевина, ионизирующее излучение Ex. В результате химического индуцированного мутагенеза и селекции на клеточном уровне были отобраны мутантные клеточные линии раувольфии змеиной, содержащей в 10 раз больше антиаритмического алкалоида аймалицина

В настоящее время наиболее приемлемый метод для накопления больших количеств вторичных метаболитов растений – В настоящее время наиболее приемлемый метод для накопления больших количеств вторичных метаболитов растений – двустадийное культивирование. Первый этап заключается в образовании больших количеств биомассы. Второй – создание условий для активного синтеза метаболитов. Создав благоприятные условия культивирования на обеих стадиях in vitro можно получить выход вторичного метаболита в количестве, синтезируемом in vivo, а иногда и выше. Состав питательной среды на втором этапе необходимо регулировать для замедления роста культуры.

Клеточные технологии для получения Системы культивирования растительных клеток экономически важных веществ для получения вторичных Клеточные технологии для получения Системы культивирования растительных клеток экономически важных веществ для получения вторичных метаболитов растительного происхождения СИСТЕМЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК ЛАБОРАТОРНЫЕ ПРОМЫШЛЕННЫЕ

ПРЕИМУЩЕСТВА ИСПОЛЬЗОВАНИЯ БИОРЕАКТОРОВ: • возможность отбирать пробы большого объема, существенно не нарушая процесс культивирования; ПРЕИМУЩЕСТВА ИСПОЛЬЗОВАНИЯ БИОРЕАКТОРОВ: • возможность отбирать пробы большого объема, существенно не нарушая процесс культивирования; • возможность управления процессом культивирования по определенному алгоритму на основе показаний датчиков, установленных в биореакторе.

ТИПЫ БИОРЕАКТОРОВ 1 ГРУППА 2 2 ГРУППА (СПОСОБ ПЕРЕМЕШИВАНИЯ – МЕХАНИЧЕСКИЙ): (СПОСОБ ПЕРЕМЕЩИВАНИЯ – ТИПЫ БИОРЕАКТОРОВ 1 ГРУППА 2 2 ГРУППА (СПОСОБ ПЕРЕМЕШИВАНИЯ – МЕХАНИЧЕСКИЙ): (СПОСОБ ПЕРЕМЕЩИВАНИЯ – АЭРИРОВАНИЕ ВОЗДУХОМ): 4 – биореактор с механическим перемешивающим устройством 1 – барботажный биореактор; 2 – аэролифтный биореактор; 3 – биореактор с вынесенной циркуляционной петлей; 1 Воздух 2 Воздух 3 Воздух 4 Воздух Принципиальные схемы биореакторов, наиболее часто применяемых для культивирования клеточных суспензий

Клеточные технологии для получения экономически важных веществ Способы перемешивания растительного происхождения Признак аэрация механические Клеточные технологии для получения экономически важных веществ Способы перемешивания растительного происхождения Признак аэрация механические перемешивающие устройства Преимуществ Самый простой и Может быть а наиболее мягкий способ использован для перемешивания очень широкого диапазона концентраций биомассы Недостатки Сложности в перемешивании возникают при высоких концентрациях биомассы; Избыток кислорода может вызывать Механическое стрессовое воздействие перемешивающего устройства на клеточную популяцию

РЕЖИМЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НАКОПИТЕЛЬНОЕ НЕПРЕРЫВНОЕ ПОЛУПРОТОЧНОЕ ОТКРЫТОЕ Хемостат Турбидостат ЗАКРЫТОЕ РЕЖИМЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ НАКОПИТЕЛЬНОЕ НЕПРЕРЫВНОЕ ПОЛУПРОТОЧНОЕ ОТКРЫТОЕ Хемостат Турбидостат ЗАКРЫТОЕ

Тип Характеристика Клеточные технологии для получения культивирования экономически важных веществ Размножение популяции клеток осуществляется Тип Характеристика Клеточные технологии для получения культивирования экономически важных веществ Размножение популяции клеток осуществляется Накопительное в закрытой системе в постоянном объеме питательной среды растительного происхождения В системе в течение всего периода выращивания Непрерывное - полупроточный режим создается, с одной стороны, приток питательной среды, а с другой стороны, отток среды или биомассы Основан на принципе отбора, определенной части клеточной суспензии через определенные интервалы времени и разбавлении оставшейся части свежей средой В систему периодически подается свежая питательная среда, а старая удаляется в том - закрытый проточный же объеме. Клетки при этом остаются в режим системе в течение всего цикла выращивания - открытый проточный режим Используются автоматизированные культуральные сосуды – ферментеры. В них по заданной программе с постоянной скоростью непрерывно подается свежая среда, и с такой же скоростью отбирается часть культуры. Общий объем культуры при

Клеточные технологии для получения Некоторые проблемы, возникающие при экономически важных веществ культивировании клеток в Клеточные технологии для получения Некоторые проблемы, возникающие при экономически важных веществ культивировании клеток в биореакторах: растительного происхождения 1) оседание клеток вследствие перемешивания, которое приводит “мертвых” зон; недостаточного к появлению 2) увеличение вязкости суспензии вследствие роста биомассы, приводящее к адгезии – прилипанию клеток другу, поверхности культурального сосуда, погруженных в него мешалок и датчиков; 3) образование в верхней части сосуда “корки” или “безе”, состоящей из полисахаридов, белков, слипшихся клеток.

Клеточные технологии для получения Этапы работы по созданию технологий экономически важных веществ получения БАВ Клеточные технологии для получения Этапы работы по созданию технологий экономически важных веществ получения БАВ на основе культивируемых растительных клеток растительного происхождения Экономически обоснованный выбор объекта Введение объекта в культуру in vitro (получение каллусной культуры) Изучение полученной биомассы по качественному и количественному составу вторичных метаболитов Оптимизация питательной среды и параметров выращивания

Клеточные технологии для получения экономически важных веществ растительного происхождения Получение высокопродуктивных клеточных линий Первичное Клеточные технологии для получения экономически важных веществ растительного происхождения Получение высокопродуктивных клеточных линий Первичное использование лучших линий в суспензионной культуре Выращивание продуктивной и устойчивой суспензионной культуры в условиях, приближающихся к производственным Составление технического регламента на производство биомассы

Клеточные технологии для получения экономически важных веществ растительного происхождения СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ! Клеточные технологии для получения экономически важных веществ растительного происхождения СПАСИБО ЗА ВНИМАНИЕ!