КОНЦЕПЦИЯ КЛЕТОЧНОЙ РАДИОЧУСТВИТЕЛЬНОСТИ На основе многочисленных экспериментов

КОНЦЕПЦИЯ КЛЕТОЧНОЙ РАДИОЧУСТВИТЕЛЬНОСТИ

На основе многочисленных экспериментов было предположение о выдвинуто том, что радиочувствительность клеток прямопропорциональная занимаемому объему, хромосомами интерфазе. Это заключение обосновано данными радиочувствительности растений. (рис. 1) в было исследования 14 видов

Рис1. Регрессионный анализ зависимости между интерфазным объемом хромосом ( 3) и дозой рентгеновского облучения, вызывающего выраженную задержку роста (к. Р)

ОТНОСИТЕЛЬНАЯ РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ КЛЕТОК НА РАЗЛИЧНЫХ СТАДИЯХ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА В экспериментах с фракционированным облучением, когда время между фракциями облучения составляло 0 -6 часов, было показано, что снижение эффективности радиационного воздействия достигалось при сохранении клеток в субоптимальных условиях культивирования (например, при снижении температуры до комнатной). В то же время, поддержание клеток в физиологически комфортных условиях резко повышало эффективность радиации. Как оказалось, это явление было обусловлено нарушением прохождения клетками клеточного цикла при помещении их в субоптимальные условия.

клеточный цикл и цикл синтеза ДНК может быть условно разделен на 4 фазы: 1 -я фаза - период клеточного деления (М-фаза), митоз, который длится у большинства клеток около 1 часа; 2 -я фаза - период покоя, следующий непосредственно за митозом (G 1 -фаза), продолжительность которого в зависимости от типа клеток может варьировать в очень широких пределах; 3 -я фаза - период синтеза или репликации ДНК (S-фаза), которая также в зависимости от типа клеток может варьировать от 6 до 15 часов; 4 -я фаза - интервал покоя между S-фазой и следующим митозом (G 2 -фаза), который длится в основном 3 -4 часа (лимфоциты в этом отношении представляют большое исключение). Молекулярные маркеры экологического воздействия

Для изучения радиорезистентности клеток на отдельных фазах клеточного цикла, клеточные популяции должны быть синхронизированы. Обычно это достигается с использованием двух методических подходов – фармакологическая синхронизация (добавление в питательную среду физиологически активных препаратов; например, избытка тимидина или гидроксимочевины, необратимо блокирующих синтез ДНК и фиксирующих клетки на границе G 1 -S), митотической селекции, основанной на том, что клетки в стадии митоза обладают меньшей адгезивной способностью и легко отделяются от дна культурального сосуда при осторожном встряхивании. Молекулярные маркеры экологического воздействия

Рис. 2. Зависимость выживания клеток китайского хомячка после одноразового рентгеновского облучения от стадии клеточного цикла Молекулярные маркеры экологического воздействия

В целом ряде исследований на различных клеточных линиях млекопитающих были получены в общем аналогичные результаты, которые можно кратко суммировать следующим образом: Клетки наиболее радиочувствительны на стадии митоза, и/или в короткие временные периоды, непосредственно до или после него; Период максимальный радиорезистентности приходится чаще всего на позднюю S- фазу; Если для данного типа клеток G 1 -фаза достаточно продолжительна, то в ее ранней стадии клетки довольно радиорезистентны и становятся значительно более радиочувствительными по мере приближения к границе G 1 -S; Как правило, G 2 -фаза для большинства типов клеток достаточно радиочувствительна, в некоторых случаях даже больше, чем фаза митоза.

ВЛИЯНИЕ МАЛЫХ ДОЗ РАДИАЦИИ НА КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ клеточный цикл представляет собой детерминированный ряд закономерно сменяющих друга состояний, протекающих в строгой последовательности, регулируемых генетическим аппаратом клетки и модифицируемых влиянием экзогенных факторов.

Существенное изменение клеточного цикла имеет место при воздействии даже малых доз радиации. Методом проточной цитофлуориметрии изучены основные показатели клеточного цикла гемопоэтической ткани при низкодозовом облучении, которые включали распределение клеток костного мозга по стадиям клеточного цикла.

В ранние сроки (8 -16 ч) после облучения животных в дозах более 1 Гр отмечали увеличение содержания миелокариоцитов в стадии G 2+М, что связано с блоком пролиферации и накоплением клеток в фазе G 2. Уже через 24 часа доля клеток в этой фазе приближалась к норме. Параллельно происходило достаточно резкое снижение количества миелокариоцитов в S-стадии. Клетки, находящиеся в премитотической фазе, предварительно проходят период синтеза ДНК, и их содержание обычно зависит от состояния S-фазы. Достаточно высокая доля клеток в фазе G 2+М при низкой их доле в S-фазе свидетельствует о задержке (блоке) клеточного цикла в стадии G 2. Этот показатель можно оценивать не по доле клеток в фазе G 2+М во всей популяции, а по соотношению S/G 2+М.

Снижение доли миелокариоцитов в стадии синтеза ДНК происходило главным образом за счет блока в фазе G 1/G 0. При значительных дозах радиации (4 -13 Гр) через 24 ч после облучения наблюдали более чем 3 -кратное снижение числа клеток в S-фазе. Через 48 ч отмечалась тенденция к увеличению доли миелокариоцитов в этой стадии, что можно расценивать как признак восстановления их пролиферативной активности.

При низкодозовых радиационных воздействиях на гемопоэтические клетки зависимости доза-эффект для клеток в S-фазе через 24 и 48 ч после воздействия были весьма сходными. В диапазоне доз от 1 до 6 Гр они имели линейный характер в полулогарифмическом масштабе и адекватно отображались логарифмическими функциями. При аппроксимировании, кривая дозаэффект для 24 ч интервала выражалась уравнением:

S = a - b ln D (6>D>0, 5) , где S - доля клеток в стадии синтеза ДНК (в %); D - доза радиации (в Гр);

Математический анализ, основанный на использовании указанной зависимости, позволяет с высокой чувствительностью выявить реагирование на сравнительно низкие дозы радиации при достаточно широком диапазоне интенсивности воздействия. Следует подчеркнуть, что в данном случае снижение долевого содержания клетки в фазе синтеза ДНК фактически отражает выраженность развития блока в стадиях G 1 и G 2.

Нарушения нормального течения клеточного цикла сопровождаются, как правило, нарастанием пострадиационной гибели миелокариоцитов, что приводит к развитию синдрома клеточного опустошения костного мозга. Как правило, количественные изменения в популяции гемопоэтических клеток характеризовались 3 фазами : опустошение. - временная стабилизация - восстановление. Молекулярные маркеры экологического воздействия

Нарушения клеточного цикла были более динамичны и по времени несколько опережали сдвиги в численном содержании клеток костного мозга. Это свидетельствуето том, что процессы пострадиационной гибели миелокариоцитов в определенной степени имеют вторичный характер по отношению к развитию изменений в прохождении клеточного цикла.

Особенности течения клеточного цикла при радиационных воздействиях в других тканях изучены гораздо менее подробно. При этом следует отметить, что специализированные клеточные популяции во взрослом многоклеточном организме различаются по своему пролиферативному потенциалу.

После воздействия на клетки радиации, нормальное течение клеточного цикла (синтез ДНК, митоз) нарушается. Клетки обладают системой защиты, контролируемой "контрольными" точками, блокирующими начало ключевых событий клеточного цикла, и тем самым, обеспечивающими компенсацию предшествующих повреждающих событий.

В этих контрольных точках решается дальнейшая судьба клеток - они могут переходить в состояние покоя, дифференциации, старения, могут продолжить движение по циклу или подвергнуться апоптозу - в зависимости от преобладающих эндо- и экзогенных условий. Поскольку в поврежденных клетках контрольные молекулярные механизмы, часто нарушены, то и эти контрольные точки часто блокированы или недостаточно эффективны, что является обязательной предпосылкой возникновению геномной нестабильности и/или гибели клеток.

Принято считать, что в интерфазе имеют место 2 главные контрольные точки, обозначаемые как G 1/S и G 2/M. Их основная задача (в соответствии с положением в цикле) - предотвращать репликацию поврежденной ДНК в Sфазе (G 1/S точка) и расхождение поврежденных хромосом в митозе (G 2/M точка).

Роль p 53 в регуляции G 1/S контрольной точки Как известно, ген р53 играет критическую роль в реакции многих типов клеток на повреждение ДНК. Активность р53 в клетке начинает быстро нарастать сразу после облучения, параллельно с возникновением конформационных изменений самого белка. В неактивном конформационном состоянии, p 53 быстро деградирует и, как правило, присутствует в клетках в относительно низких концентрациях, но в активном состоянии он более устойчив и может накапливаться в клетке в значительном количестве.

Тот факт, что ген p 53 дикого типа необходим для G 1 -блока, свидетельствует о том, что он может рассматриваться в качестве "охранника генома", а сама по себе эта задержка гарантирует клетке больше времени для репарирования повреждений ДНК перед вхождением в S-фазу. На основании этой гипотезы можно предположить, что клетки с диким типом p 53 сохраняют способность к выживанию после облучения за счет купирования повреждений, которые в противном случае могли бы оказаться летальными. Однако, вопреки ожиданию функция p 53 дикого типа связана скорее с гибелью клеток, чем с их выживанием.

G 2/M переход. Контрольная точка G 2 Клетки, утратившие ген p 53 дикого типа, минуют G 1 -блок и способны закончить весь цикл синтеза ДНК, но при этом немедленное начало конденсации хромосом и переход к митозу не происходят. Отсроченное начало наблюдается в воздействию митоза клетках, (G 2 -блок) которые ионизирующей обычно подверглись радиации, химиопрепаратов или ингибиторов топоизомераз.

Выход из G 2 -блока: p 53 независимый механизм клеточной гибели Недавно полученные данные позволили обосновать предположение о том, что наличие радиационно-индуцированного G 2 блока может предшествовать апоптозу. В 1994 году была предложена классификация радиационно-индуцированной гибели для культуральных лимфоидных клеточных линий, основанную на времени, необходимом для потери жизнеспособности после облучения.

Клеточные линии погибали практически сразу на протяжении первой пост-радиационной G 1 фазы (так называемая "быстрая интерфазная гибель"), в то время как другие теряли жизнеспособность медленнее, обычно на стадии G 2 фазы ("отсроченная интерфазная гибель"), либо после одного или нескольких клеточных делений ("ранняя митотическая / отсроченная митотическая" гибель). Предполагалось, что двойные разрывы ДНК непосредственно стимулировали клеточную гибель в "быстрых интерфазных" клеточных линиях, в то время как основным сигналом для отсроченной интерфазной и метафазной гибели "поздних" линий служили непосредственно хромосомные аберрации.