КОНЦЕПЦИЯ КЛЕТОЧНОЙ РАДИОЧУСТВИТЕЛЬНОСТИ

КОНЦЕПЦИЯ КЛЕТОЧНОЙ РАДИОЧУСТВИТЕЛЬНОСТИ

Sparrow выдвинул предположение о том, что радиочувствительность клеток прямопропорциональная объему, занимаемому хромосомами в интерфазе. Это заключение он обосновал данными исследования радиочувствительности 14 видов растений. Данные, полученные им суммированы на рис. 1: Молекулярные маркеры экологического воздействия

Рис1. Регрессионный анализ зависимости между интерфазным объемом хромосом ( 3) и дозой рентгеновского облучения, вызывающего выраженную задержку роста (к. Р) Молекулярные маркеры экологического воздействия

Несмотря на то, что наиболее чувствительной частью клетки является ядро, некоторые другие клеточные структуры могут играть важную роль при радиационных воздействиях. Наиболее информативным источником для изучения влияния радиации на структуры цитоплазмы послужила электронная микроскопия. По данным этого метода после облучения наблюдается разбухание и вакуолизация клетки, дезинтеграция митохондрий и эндоплазматического ретикулума , некоторое снижение числа полисом. Существенное повреждающее и функционально дезинтеграционное влияние радиация оказывает на клеточные мембраны. Молекулярные маркеры экологического воздействия

Goldfeder показала, что для ряда клеток митохондрии являются определяющим фактором радиочувствительности. По ее данным, эпителиальные опухоли, имеющие большое количество митохондрий более радиорезистентны , чем веретенчатые клетки, имеющие небольшое количество митохондрий. В развитие своего предположения, она провела сравнительное исследование радиочувствительности клеток сердечной мышцы (большое количество митохондрий) и лимфоцитов (несколько митохондрий). Как и в первом случае, клетки, богатые митохондриями, оказались более радиорезистентными. Таким образом, можно предположить, что количество митохондрий может служить мерой радиорезистентности. Однако, накопленный к настоящему времени практический материал недостаточен для окончательных выводов. Молекулярные маркеры экологического воздействия

ОТНОСИТЕЛЬНАЯ РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ КЛЕТОК НА РАЗЛИЧНЫХ СТАДИЯХ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА В экспериментах с фракционированным облучением, когда время между фракциями облучения составляло 0 -6 часов, было показано, что снижение эффективности радиационного воздействия достигалось при сохранении клеток в субоптимальных условиях культивирования (например, при снижении температуры до комнатной). В то же время, поддержание клеток в физиологически комфортных условиях резко повышало эффективность радиации. Как оказалось, это явление было обусловлено нарушением прохождения клетками клеточного цикла при помещении их в субоптимальные условия. Молекулярные маркеры экологического воздействия

клеточный цикл и цикл синтеза ДНК может быть условно разделен на 4 фазы: 1 -я фаза - период клеточного деления (М-фаза), митоз, который длится у большинства клеток около 1 часа; 2 -я фаза - период покоя, следующий непосредственно за митозом (G 1 -фаза), продолжительность которого в зависимости от типа клеток может варьировать в очень широких пределах; 3 -я фаза - период синтеза или репликации ДНК (S-фаза), которая также в зависимости от типа клеток может варьировать от 6 до 15 часов; 4 -я фаза - интервал покоя между S-фазой и следующим митозом (G 2 -фаза), который длится в основном 3 -4 часа (лимфоциты в этом отношении представляют большое исключение). Молекулярные маркеры экологического воздействия

Для изучения радиорезистентности клеток на отдельных фазах клеточного цикла, клеточные популяции должны быть синхронизированы. Обычно это достигается с использованием двух методических подходов – фармакологическая синхронизация (добавление в питательную среду физиологически активных препаратов; например, избытка тимидина или гидроксимочевины , необратимо блокирующих синтез ДНК и фиксирующих клетки на границе G 1 -S), митотической селекции , основанной на том, что клетки в стадии митоза обладают меньшей адгезивной способностью и легко отделяются от дна культурального сосуда при осторожном встряхивании. Молекулярные маркеры экологического воздействия

Рис. 2. Зависимость выживания клеток китайского хомячка после одноразового рентгеновского облучения от стадии клеточного цикла Молекулярные маркеры экологического воздействия

В целом ряде исследований на различных клеточных линиях млекопитающих были получены в общем аналогичные результаты, которые можно кратко суммировать следующим образом: Клетки наиболее радиочувствительны на стадии митоза, и/или в короткие временные периоды, непосредственно до или после него; Период максимальный радиорезистентности приходится чаще всего на позднюю S- фазу; Если для данного типа клеток G 1 -фаза достаточно продолжительна, то в ее ранней стадии клетки довольно радиорезистентны и становятся значительно более радиочувствительными по мере приближения к границе G 1 -S; Как правило, G 2 -фаза для большинства типов клеток достаточно радиочувствительна , в некоторых случаях даже больше, чем фаза митоза. Молекулярные маркеры экологического воздействия

ВЛИЯНИЕ МАЛЫХ ДОЗ РАДИАЦИИ НА КЛЕТОЧНЫЙ ЦИКЛ клеточный цикл представляет собой детерминированный ряд закономерно сменяющих друга состояний, протекающих в строгой последовательности, регулируемых генетическим аппаратом клетки и модифицируемых влиянием экзогенных факторов. Молекулярные маркеры экологического воздействия

Существенное изменение клеточного цикла имеет место при воздействии даже малых доз радиации. Методом проточной цитофлуориметрии изучены основные показатели клеточного цикла гемопоэтической ткани при низкодозовом облучении, которые включали распределение клеток костного мозга по стадиям клеточного цикла. Молекулярные маркеры экологического воздействия

В ранние сроки (8 -16 ч) после облучения животных в дозах более 1 Гр отмечали увеличение содержания миелокариоцитов в стадии G 2+М, что связано с блоком пролиферации и накоплением клеток в фазе G 2. Уже через 24 часа доля клеток в этой фазе приближалась к норме. Параллельно происходило достаточно резкое снижение количества миелокариоцитов в S-стадии. Клетки, находящиеся в премитотической фазе, предварительно проходят период синтеза ДНК, и их содержание обычно зависит от состояния S-фазы. Достаточно высокая доля клеток в фазе G 2+М при низкой их доле в S-фазе свидетельствует о задержке (блоке) клеточного цикла в стадии G 2. Этот показатель можно оценивать не по доле клеток в фазе G 2+М во всей популяции, а по соотношению S/G 2+М. Молекулярные маркеры экологического воздействия

Снижение доли миелокариоцитов в стадии синтеза ДНК происходило главным образом за счет блока в фазе G 1/G 0. При значительных дозах радиации (4 -13 Гр) через 24 ч после облучения наблюдали более чем 3 -кратное снижение числа клеток в S-фазе. Через 48 ч отмечалась тенденция к увеличению доли миелокариоцитов в этой стадии, что можно расценивать как признак восстановления их пролиферативной активности. Молекулярные маркеры экологического воздействия

При низкодозовых радиационных воздействиях на гемопоэтические клетки зависимости доза-эффект для клеток в S-фазе через 24 и 48 ч после воздействия были весьма сходными. В диапазоне доз от 1 до 6 Гр они имели линейный характер в полулогарифмическом масштабе и адекватно отображались логарифмическими функциями. При аппроксимировании, кривая доза- эффект для 24 ч интервала выражалась уравнением: Молекулярные маркеры экологического воздействия

S = a - b ln D (6>D>0, 5) , где S - доля клеток в стадии синтеза ДНК (в %); D - доза радиации (в Гр); a и b - коэффи опытным путем (в данном случае a = 13, 0, b = 4, 42). Зависимость доза-эффект для 48 ч пострадиационного интервала описывалась аналогичными функциями с коэффициентами a = 23, 0, b =9, 1 для дозового диапазона 1 - 6 Гр Молекулярные маркеры экологического воздействия

Математический анализ, основанный на использовании указанной зависимости, позволяет с высокой чувствительностью выявить реагирование на сравнительно низкие дозы радиации при достаточно широком диапазоне интенсивности воздействия. Следует подчеркнуть, что в данном случае снижение долевого содержания клетки в фазе синтеза ДНК фактически отражает выраженность развития блока в стадиях G 1 и G 2. Молекулярные маркеры экологического воздействия

Нарушения нормального течения клеточного цикла сопровождаются, как правило, нарастанием пострадиационной гибели миелокариоцитов , что приводит к развитию синдрома клеточного опустошения костного мозга. Как правило, количественные изменения в популяции гемопоэтических клеток характеризовались 3 фазами : - опустошение. - временная стабилизация - восстановление. Молекулярные маркеры экологического воздействия

Нарушения клеточного цикла были более динамичны и по времени несколько опережали сдвиги в численном содержании клеток костного мозга. Это свидетельствуето том, что процессы пострадиационной гибели миелокариоцитов в определенной степени имеют вторичный характер по отношению к развитию изменений в прохождении клеточного цикла. Молекулярные маркеры экологического воздействия

Особенности течения клеточного цикла при радиационных воздействиях в других тканях изучены гораздо менее подробно. При этом следует отметить, что специализированные клеточные популяции во взрослом многоклеточном организме различаются по своему пролиферативному потенциалу. Их подразделяют на три основных группы: Статичные , или непролиферирующие клеточные популяции, утратившие способность к пролиферации в нормальных физиологических условиях. Растущие , или медленно пролиферирующие клеточные популяции, характеризующиеся низкой митотической активностью и незначительным уровнем гибели клеток. Эти клетки сохраняют способность к пролиферации при благоприятных условиях. Молекулярные маркеры экологического воздействия

Обновляющиеся клеточные популяции, в которых высокий уровень пролиферации уравновешивается гибелью клеток. В этих клеточных популяциях основная масса клеток мигрирует, специализируется, претерпевает терминальную дифференцировку и погибает. Небольшая фракция клеток обновляющихся популяций (стволовые клетки) сохраняет на всем протяжении своей жизни пролиферативный потенциал и способность к самоподдержанию и дифференцировке, восполняя клеточную потерю популяции. Молекулярные маркеры экологического воздействия

Необходимо отметить, что данные экспериментальной онкологии и эпидемиологии опухолевых новообразований свидетельствуют о том, что нарушения нормального течения клеточного цикла и пролиферационного потенциала являются одним из необходимых условий появления новообразований в любой ткани. У человека 80 -90% опухолей возникает в органах и тканях с обновляющимся клеточным составом и довольно высоким пролиферационным потенциалом. Остальные 10 -20% источников опухолевого роста составляют покоящиеся клеточные популяции в органах, стабилизирующихся после завершения формирования взрослого организма, или популяции с низкой скоростью обновления и небольшим пролиферационным потенциалом. Молекулярные маркеры экологического воздействия

При неопластической трансформации регуляторные механизмы пролиферации нарушаются, и клетки становятся менее зависимыми от внешних стимуляторов. Благодаря гибкой системе контроля клеточного размножения, в трансформированных клетках сохраняются условия, позволяющие им переходить в состояние покоя. Наличие в опухоли покоящихся клеток представляет собой одну из серьезных проблем в клинической онкопатологии , поскольку такие клетки обладают значительной резистентностью к противоопухолевым препаратам и действию других повреждающих факторов. Молекулярные маркеры экологического воздействия

После воздействия на клетки радиации или химиопрепаратов, нормальное течение клеточного цикла (синтез ДНК, митоз) нарушается. Как нормальные, так и трансформированные злокачественные клетки обладают системой защиты, контролируемой "контрольными" точками, блокирующими начало ключевых событий клеточного цикла, и тем самым, обеспечивающими компенсацию предшествующих повреждающих событи. Молекулярные маркеры экологического воздействия

В этих контрольных точках решается дальнейшая судьба клеток - они могут переходить в состояние покоя, дифференциации, старения, могут продолжить движение по циклу или подвергнуться апоптозу - в зависимости от преобладающих эндо- и экзогенных условий. Поскольку в опухолевых клетках контрольные молекулярные механизмы, часто нарушены, то и эти контрольные точки часто блокированы или недостаточно эффективны, что является обязательной предпосылкой возникновению геномной нестабильности и/или гибели клеток. Молекулярные маркеры экологического воздействия

Принято считать, что в интерфазе имеют место 2 главные контрольные точки, обозначаемые как G 1/S и G 2/M. Их основная задача (в соответствии с положением в цикле) - предотвращать репликацию поврежденной ДНК в S- фазе (G 1/S точка) и расхождение поврежденных хромосом в митозе (G 2/M точка). Молекулярные маркеры экологического воздействия

Роль p 53 в регуляции G 1/S контрольной точки Как известно, ген р53 играет критическую роль в реакции многих типов клеток на повреждение ДНК. Активность р53 в клетке начинает быстро нарастать сразу после облучения, параллельно с возникновением привлечением конформационных изменений самого белка. В неактивном конформационном состоянии, p 53 быстро деградирует и, как правило, присутствует в клетках в относительно низких концентрациях, но в активном состоянии он более устойчив и может накапливаться в клетке в значительном количестве. Молекулярные маркеры экологического воздействия

Активный p 53 функционирует как транскрипторный активатор отдельных генов, включая mdm 2, gadd 45 и waf 1/cip 1. Продукт mdm 2 гена, связываясь с избытком p 53 белка, образует неактивный комплекс, вследствие чего формируется петля отрицательной обратной связи, которая может служить буфером в поддержании оптимальной p 53 концентрации. Функция gadd 45 не была точно выяснена, но полагают, что он имеет значение при репарировании некоторых типов повреждения ДНК. Молекулярные маркеры экологического воздействия

Тот факт, что ген p 53 дикого типа необходим для G 1 -блока, свидетельствует о том, что он может рассматриваться в качестве "охранника генома", а сама по себе эта задержка гарантирует клетке больше времени для репарирования повреждений ДНК перед вхождением в S-фазу. На основании этой гипотезы можно предположить, что клетки с диким типом p 53 сохраняют способность к выживанию после облучения за счет купирования повреждений, которые в противном случае могли бы оказаться летальными. Однако, вопреки ожиданию функция p 53 дикого типа связана скорее с гибелью клеток, чем с их выживанием. Молекулярные маркеры экологического воздействия

G 2/M переход. Контрольная точка G 2 Клетки, утратившие ген p 53 дикого типа, минуют G 1 -блок и способны закончить весь цикл синтеза ДНК, но при этом немедленное начало конденсации хромосом и переход к митозу не происходят. Отсроченное начало митоза (G 2 -блок) обычно наблюдается в клетках, которые подверглись воздействию ионизирующей радиации, химиопрепаратов или ингибиторов топоизомераз. Молекулярные маркеры экологического воздействия

Механизмы, предотвращающие вхождение поврежденных клеток в митоз полностью не изучены. Одним из наиболее важных моментов в инициировании митотических событий в необлученных клетка млекопитающих является активация p 34 cdc 2 киназы , которая катализирует широкомасштабное фосфориллирование гистонов. В клетках, которые были блокированы в G 2 после облучения или воздействия этапозида , p 34 cdc 2 быстро инактивируется и остается в тирозин- фосфориллированном состоянии. При воздействии после облучения в пролиферирующих клетках кофеин предотвращает инактивацию p 34 cdc 2. При этом, активируя p 34 cdc 2, он дает возможность клеткам преждевременно входить в митоз даже при наличии поврежденной ДНК. Молекулярные маркеры экологического воздействия

Клетки, дефицитные по функционально активному гену p 53, зависят в большей степени от G 2 - блока, чем клетки с нормальной экспрессией p 53 дикого типа, которые имели дополнительное время для репарации повреждений ДНК на протяжении G 1 -блока. Молекулярные маркеры экологического воздействия

Выход из G 2 -блока: p 53 независимый механизм клеточной гибели Недавно полученные данные позволили обосновать предположение о том, что наличие радиационно-индуцированного G 2 - блока может предшествовать апоптозу. Radford [1994 c] предложил классификацию радиационно-индуцированной гибели для культуральных лимфоидных клеточных линий, основанную на времени, необходимом для потери жизнеспособности после облучения. Молекулярные маркеры экологического воздействия

Клеточные линии погибали практически сразу на протяжении первой пост-радиационной G 1 фазы (так называемая " быстрая интерфазная гибель "), в то время как другие теряли жизнеспособность медленнее, обычно на стадии G 2 фазы ("отсроченная интерфазная гибель"), либо после одного или нескольких клеточных делений (" ранняя митотическая / отсроченная митотическая" гибель). Предполагалось, что двойные разрывы ДНК непосредственно стимулировали клеточную гибель в "быстрых интерфазных " клеточных линиях, в то время как основным сигналом для отсроченной интерфазной и метафазной гибели "поздних" линий служили непосредственно хромосомные аберрации. Молекулярные маркеры экологического воздействия