Количественный анализ нуклеиновых кислот Количественный анализ нуклеиновых

Количественный анализ нуклеиновых кислот

Количественный анализ нуклеиновых кислот — определение концентрации ДНК или РНК в смеси или чистом препарате. Для определения концентрации ДНК и РНК в растворе широко используются два метода. Наиболее простым и точным является спектрофотометрический метод, однако он обладает сравнительно малой чувствительностью. Если общее содержание нуклеиновых кислот невелико, то концентрацию ДНК и РНК можно определить по интенсивности их флуоресценции в УФ-свете после окрашивания бромистым этидием.

Спектрофотометрический анализ Нуклеиновые кислоты определенным образом поглощают ультрафиолет. В спектрофотометрах образец подвергается действию ультрафиолета с длиной волны 260 нм, а фотодетектор измеряет количество света, прошедшего через образец. Чем больше света поглощено, тем выше концентрация нуклеиновой кислоты в образце. При помощи закона Бугера — Ламберта — Бера возможно соотнести концентрация молекул, поглощающих излучение с количеством поглощенного света.

Кюветы для анализа Для определения концентрации образца, оптическую плотность, определённую при помощи стандартной кюветы с величиной оптического пути 10 мм, необходимо умножить на соответствующий коэффициент. (например, величина поглощения 0, 9 оптических единицы двуцепочечной ДНК соответствует концентрации 45 мкг/мл. ) Кюветы малого объема Для многих биологических исследований требуется (ДНК-микрочип, количественная ПЦР) качественное и количественное определение малых объемов нуклеиновых кислот. Специальные нанофотометры позволяют определять концентрации образцов без помощи кюветы в субмикролитровых объемах, начиная от 0, 3 мкл. Так как производятся измерения неразбавленного образца, воспроизводимость результатов очень высокая, а сами образцы могут быть использованы после анализа.

Электрофоретический метод Для примерной оценки концентрации препаратов ДНК или РНК на гель наносят разные количества маркерных нуклеиновых кислот. Концентрацию исследуемых ДНК или РНК в образце оценивают, сравнивая интенсивность флуоресценции образца и стандартных маркеров с известной концентрацией. При этом важно, чтобы образцы ДНК и РНК сравнивались с соответствующими маркерами, поскольку при одинаковом количестве ДНК и РНК интенсивность их флуоресценции в УФ-свете различается. Фрагменты ДНК визуализируют при помощи флуоресцентных красителей, специфично взаимодействующих с ДНК. Обычно красят бромистым этидием, который интеркалирует между азотистыми основаниями дуплекса и флюоресцирует в УФ-лучах.

Краситель ДНК Non. Tox - флуоресцентный краситель ДНК в 6 Х- буфере для нанесения образцов на гель; используется для детекции двуцепочечной ДНК в УФ или синем (470 нм) свете как нетоксичный аналог бромистого этидия. Краситель ДНК Non. Tox позволяет быстро и с высокой чувствительностью детектировать двуцепочечную ДНК под УФ излучением или синим (470 нм) светом. Реагент полностью удовлетворяет требованиям о защите окружающей среды и используется как безопасная альтернатива бромистому этидию. Кроме того, данный краситель не влияет на структуру и целостность молекулы ДНК.

Спасибо за внимание!