Количественные и качественные методы выявления АГ и АТ

Количественные и качественные методы выявления АГ и АТ Иммуноанализы

Методы 1) Иммунодиффузия • простая радиальная по Манчини (количественный ан. ) • простая линейная по Удену (количественный анализ) • встречная по Оухтерлони (качественный анализ) 2) Имуноэлектрофорез (качественный, кроме ракетного) • ракетный • встречный • двумерный • продольный 3) Иммуноблоттинг 4) Радиоиммунный анализ (РИА) 5) Иммуноферментный анализ (ИФА)

Иммунодиффузия по Манчини Принцип метода: на ровную поверхность ровным слоем наносят гель, содержащий АТ. В геле вырезают лунки и заполняют их раствором АГ. Молекулы АГ радиально диффундируют из лунки и, встретившись с АТ, образуют кольца преципитации. До тех пор, пока в лунке сохраняется избыток АГ, происходит постепенное увеличение кольца преципитации.

Постановка иммунодиффузии 1. 1, 5 г агара нагревают до полного растворения в 100 мл веронал-ацетатного буфера на водяной бане, смешивают в нужной пропорции с антисывороткой. 2. Смесь разливают по 2 мл на предметные стекла, расположенные строго горизонтально. 3. В пластинке геля вырезают лунки, рассчитанные на 2 мкл антигенного раствора каждая. 4. Вносят АГ; пластинки геля помещают во влажную камеру и проводят иммунодиффузию при комнатной температуре. 5. Если преципитаты видны недостаточно четко, сначала элюируют непреципитировавшие белки в двух сменах 0, 15 М раствора Na. Cl по 12 часов, зачем гель высушивают и окрашивают красителями, например, амидно-черным, и высушивают вновь.

Оценка результатов Площадь, занимаемая преципитатом к концу диффузии, прямо пропорциональна исходной концентрации антигена в лунке. S=K*QAГ+S 0, где S – площадь преципитата, включая S 0, S 0 – площадь стартовой лунки и QAГ -- концентрация антигена. Для построения калибровочной кривой берут чаще всего квадрат диаметра преципитата как функцию концентрации антигена.

Оценка метода • В пределах своей чувствительности радиальная иммунодиффузия пригодна для количественного определения любого антигена, если имеются соответствующие моноспецифические антисыворотки и чистые или стандартные антигены, чтобы построить калибровочную кривую для данной системы. • При помощи этого метода чаще определяют белковые антигены, например, белки сыворотки крови, цереброспинальной жидкости, секретов желез.

Иммунодиффузия по Удену Принцип метода: гель, содержащий антисыворотку, помещают в стеклянные трубки или пробирки. Трубки вертикально погружают в раствор антигена, в пробирках раствор антигена наслаивают на гель. Антигены диффундируют в гель со скоростью, пропорциональной их концентрации, и, соединившись со специфическими антителами, образуют с ними беловато-мутные преципитаты. Чем продолжительнее диффузия, тем дальше фронт преципитации каждой линии удаляется от границы, разделяющей гель и жидкость. Расстояние, которое он проходит за определенное время при строго постоянной концентрации антисыворотки в геле, зависит только от концентрации диффундирующего антигена. При постоянных условия опыта (температура, серия антисыворотки и ее концентрация в геле, концентрация самого геля) с помощью простой линейной иммунодиффузии можно определять количество антигена.

Постановка иммунодиффузии 1. В стеклянные капилляры насасывают и выдувают обратно 1%-ный горячий золь агара на воде. Затем капилляры высушивают при 70°С. Образовавшаяся агаровая пленка усиливает сцепление геля со стеклом и препятствует образованию щелей, в которые мог бы проникнуть антиген. 2. В 100 мл веронал-ацетатного буфера суспендируют 2 г сухого агара и нагревают на водяной бане до расплавления; затем смешивают с равным объемом антисыворотки. В эту смесь погружают капилляры, чтобы она заполнила их на 2 -3 см. Когда гель затвердеет, капилляры готовы к использованию. 3. Капилляры погружают в раствор антигенов. (Реагенты перед этим должны быть доведены до нужной температуры, например, 4 С). Реакция длится 48 часов. Затем измеряют расстояние, которое прошел фронт преципитации в каждом капилляре.

Оценка результатов • Для того, чтобы антиген мог диффундировать в гель, содержащий антитела, он должен быть в избытке. Скорость миграции преципитата К можно вычислить, разделив расстояние h на время диффузии t. • При постоянном времени диффузии между логарифмом концентрации антигена и расстоянием, которое проходит фронт преципитации, существует прямая линейная зависимость. Наклон калибровочной кривой прямо пропорционален квадрату коэффициента диффузии антигена и обратно пропорционален концентрации антител в геле и вязкости геля.

Иммунодиффузия по Оухтерлони Принцип метода: в слое агарового геля равномерной толщины на определенном расстоянии друг от друга вырезают лунки для антигена и антисыворотки и заполняют их соответствующими растворами. После этого антигены и антитела диффундируют в гель, встречаются друг с другом и образуют иммунные комплексы, которые преципитируют в полях геля и становятся видимыми как линии преципитации.

Постановка иммунодиффузии 1. Расплавляют агар (1, 5 г) на водяной бане в 100 мл одного из предлагаемых растворителей (0, 15 М раствор Na Cl, веронал-ацетатный буфер с p. H 8, 6 и ионной силой 0, 1). Горячий агарозный гель разливают по 3 мл на предметные стекла, расположенные строго горизонтально. 2. Чтобы усилить сцепление геля с поверхностью стекла, предметные стекла рекомендуется покрыть агаровой пленкой (на стекло наносят 1%- ный водный агаровый золь и высушивают при 70°С) 3. Для вырезания лунок в геля применяют либо специальные штампы разного профиля, либо инъекционные иглы, металлические или стеклянные трубочки с разными краями. Лунки для антигенов и антисыворотки располагают на расстоянии не менее 4 и не более 10 мм. 4. Заполнив лунки соответствующими растворами, пластинки помещают во влажную камеру. Иммунодиффузию можно проводить при 4, 20 и 37°С. Она длится не менее 24 ч и может продолжаться до 6 -7 дней. 5. Результаты учитывают на влажном препарате или сначала удаляют непреципитировавшие белки (2 -3 раза погружают на 12 ч в ванночку с 0, 15 М раствором Na. Cl), высушивают при комнатной температуре, окрашивают, например, амидно-черным.

Двойная радиальная иммунодиффузия: возможные варианты расположения резервуаров для растворов антигена (заштрихованы) и сыворотки (черные)

Оценка результатов 1) Количество линий преципитации - два или более комплекса АГ-АТ могут формировать одну линию преципитации - могут не образовываться видимые преципитаты из-за неблагоприятного соотношения компонентов реакции => число видимых линий преципитации, как правило, меньше числа систем антиген-антитело или в лучшем случае равно ему. 2) Расположение линий преципитации При оптимальном соотношении между антигеном и антителом линия преципитации располагается почти посередине между лунками. - сдвиг линии преципитации из-за количественного преобладания одного из реагентов ? - дополнительное поступление одного из реагентов => образование «вуали» или отдельной зоны преципитации

3) Взаимное расположение линий преципитации – сравнительный анализ Для выявления полной или частичной идентичности в геле обычно вырезают три лунки, расположенные треугольником. В две из низ помещают сравниваемые растворы антигенов, а в третью – антисыворотку. 1 – обе линиции преципитации полностью сливаются, АГ идентичны. 2 – линии преципитации пересекаются, АГ различны. 3 – линии преципитации сливаются, но одна образует так называемую «шпору» : оба АГ имеют общие детерминанты (это приводит к слиянию линий); один АГ имеет больше детерминант (при наличии соответствующих АТ в сыворотке образуется «шпора» ) 4 – линии преципитации сливаются и перекрещиваются одновременно: как общие, так и специфические АГ- детерминанты.

Определение титра Готовят последовательные двукратные разведения изучаемого антигена и равные объемы каждого разведения вносят в лунки, расположенные по периферии той лунки, в которой антисыворотка (стандартный объем). При оценке результатов иммунодиффузии учитывают: 1. расстояние, отделяющее линию преципитации от центральной и периферических лунок; 2. последнее разведение антигена, которое еще дает видимый преципитат; 3. интенсивность и ширину полос преципитации. Последнее разведение антигена, дающее преципитат, считают его титром. Подобным образом можно титровать содержание антител в антисыворотке.

Область применения Двойная радиальная иммунодиффузия по Оухтерлони используется: 1. для оценки чистоты препаратов при выделении антигенов, 2. для сравнения известных антигенов и антител с неизвестными, Можно использовать и для полуколичественного определения АГ и АТ путем их титрования (путем сравнения со стандартным раствором антигена можно определить неизвестную концентрацию антигена в исследуемой пробе) Метод обладает высокой специфичностью, при количественных вариантах иммунодиффузии ошибка метода составляет 3 -7%.

Иммуноэлектрофорез (ИЭФ) — метод исследования антигенного состава биологических материалов, сочетающий электрофорез и иммунодиффузию. Впервые описан Грабаром и Уильямсом в 1953 году. Образец антигенного материала разделяют электрофорезом в геле (обычно агарозном), в результате чего формируются характерные зоны. Далее параллельно зонам электрофореза вносится преципитирующая антисыворотка, антигены и антисыворотка диффундируют навстречу друг к другу, и в месте встречи антисыворотки с антигеном появляются линии преципитации, имеющие форму дуги.

Схема иммуноэлектрофореза по Грабару и Уильямсу. В стартовые лунки для электрофореза внесены сыворотки крови двух пациентов - 1 и 2, в канавку в центре пластины по завершении электрофореза проб сывороток внесена смесь антисывороток против основных фракций сывороточных белков - альбуминов, α-, β- и γ- глобулинов. На основании данных иммуноэлектрофореза пациенту 2 поставлен диагноз агаммаглобулинемии.

Ракетный иммуноэлектрофорез Ракетный электрофорез - это метод количественного анализа; разработан на основе радиальной иммунодиффузии. Движение АГ происходит в принудительном режиме по силовым линиям электрического поля. Линия преципитации имеет форму ракеты, длина которой определяется концентрацией антигена. B – калибровка А и С – исследуемые растворы АГ

Встречный иммуноэлектрофорез Суть метода заключается в следующем: 1. исследуемые антигены и смесь антител помещают в лунки, расположенные на противоположных концах пластины с гелем; 2. вдоль линии, соединяющей лунки, пропускают постоянный электрический ток; 3. в электрическом поле антитела и антигены быстро перемещаются по направлению друг к другу; 4. в месте связывания антигенов с антителами образуются линии преципитации. Встречный иммуноэлектрофорез применяют, когда антигены и антитела обладают разной электрофоретической подвижностью. Этот метод позволяет быстро определить антитела в пробе и применяется в экспресс диагностике инфекционных заболеваниях.

Двумерный электрофорез Усложненный вариант иммуноэлектрофореза — перекрестный, или двумерный иммуноэлектрофорез, позволяющий разделить многокомпонентные смеси. Образец вносят в лунку на краю гелевой пластинки и электрофоретическим путем «прогоняют» компоненты образца по всей длине геля, пока самый подвижный компонент не приблизится к противоположному краю геля. Получается продольная дорожка на геле, которую вырезают и переносят на другую гелевую пластинку, причем эту дорожку ориентируют поперек направления электрического поля. Второй гель содержит антитела к одному или нескольким компонентам смеси, и после электрофореза на нем образуются «ракеты» , каждая из которых соответствует определенному антигену — компоненту смеси.

Иммуноблоттинг - это высокоспецифичный и высокочувствительный метод исследования белковых антигенов. Основан на сочетании гель- электрофореза и ИФА или РИА. Был разработан главным образом в целях обнаружения в сыворотках пациентов антител, реагирующих с отдельными белками возбудителей инфекционных заболеваний, чаще всего вирусов.

Если в крови у человека нет противовирусных антител, стрип остается неокрашенным – отрицательный результат. Положительный результат – все окрашенные полосы. Неопределенный результат – 1 -2 окрашенные полосы.

Схема «сэндвича» , приготовленного для блоттинга

Пример: диагностика антител класса Ig. М/Ig. G к вирусу Эпштейна-Барра методом иммуноблоттинга с возможностью определения стадии инфекции CA – капсидный АГ EA – ранний АГ NA – ядерный АГ Другие АГ p 125, р65, р42, р41, ЕА-R p 93 EBNA-1 p 79 p 27 р40, з 33, р22 (р22 – EA-D p 45 является маркером EA-D p 43 поздней фазы EBV- инфекции)