Клонирование и экспрессия гистоноподобного HU белка из Mycoplasma Gallisepticum в клетках E. coli. Ларина Дарья Сергеевна
Гистоноподобные HU белки Предшественники гистонов. Присутствуют во всех прокариотических клетках. Связанны с нуклеоидом - ядерной областью, в которой находится генетический материал. Участвуют в поддержании суперскрученности и компактизации геномной ДНК. Модулируют такие функции ДНК как репликация, рекомбинация, репарация и транскрипция.
Mycoplasma Gallisepticum • Род Mycoplasma, класс Mollicutes • Самые маленькие бактерии • Паразитический образ жизни • Модельный организм для создания искусственной клетки • Редуцированный геном, в котором в частности отсутствуют гены, кодирующие компоненты системы MMR, которая осуществляет репарацию ошибочно спаренных нуклеотидов, и тем самым поддерживает стабильность генома.
Нu-белки из микоплазмы Мы предположили, что именно гистоноподобные HU белки выполняет функцию MMR в M. Gallisepticum (M. Gal). Для проверки надо было изучить способность HU белка из M. Gal связывать фрагмент 2 -х цепочечной ДНК, содержащий «mis-match»
Схема эксперимента
Задачи 1. 2. 3. 4. 5. Клонирование гена гистоноподобного HU белка из бактерии Mycoplasma Gallisepticum. Получение штамма продуцента E. coli. Подбор условий экспрессии белка в клетках E. coli. Оптимизация методов выделения и наработка рекомбинантного белка. Кристаллизация и РСА чистого белка и комплекса белок-двухцепочечная ДНК, содержащая пару неспаренных нуклеотидов
Клонирование гена гистоноподобного HU белка из Mycoplasma Gallisepticum Нуклеотидная и аминокислотная последовательности гистоноподобного HU белка из Mycoplasma Gallisepticum.
Экспрессия рекомбинантного HU белка в клетках E. coli 1. Созданы две генетические конструкции, кодирующие: HU-белок и 6 -His-Tev-HU. 2. Получены штаммы продуценты. 3. Подобраны условия индукции и экспрессии рекомбинантных белков в ДСН-ПААГ электрофорез Е. coli.
Очистка 6 -His-Tev-HU белка Аффинная хромотография на Ni-NTA cефарозе (1). • • Обработка Tev- протеазой (2). Очистка от Tev-протеазы -> 2 -ая aффинная хромотография на Ni-NTA cефарозе (3). • Гель-фильтрация. • ДСН-ПААГ электрофорез Контроль качества полученного белка с помощью ДСН-ПААГ. •
Рентгеноструктурный анализ 1. Кристаллизация очищенного белка. Получение чистого упорядоченного кристалла ( 0, 1 -1 мм). 2. Облучение кристалла рентгеновскими лучами для получения дифракционной картины. 3. Компьютерная расшифровка структуры белка.
Кристаллизация в лаборатории и космосе
Кристаллизация белков с робатизированным комплексом Rigaku Phoenix Раскапывание белка в планшеты Alchemist Создание растворов для кристаллизации Gallery 700 Хранение планшетов. Minstrell Фотосьемка по заданному расписанию.
Последний шаг: сбор дифракционных данных с белковых кристаллов на станции кристаллографии белка на синхротронном излучателе Курчатовского НБИК центра.
Выводы Проведено клонирование гена HU белка из Mycoplasma Gallisepticum в клетки E. coli Match 1. Ген встроен в вектора – p. Notaq и p. Hispar 3 для экспрессии белка нативного типа и белка , содержащего N -концевую 6 -His последовательность. Разработан метод выделение белка , содержащего N -концевую 6 -Hisпоследовательность. Начаты эксперименты по подбору условий кристаллизации белка.
БЛАГОДАРЮ ЗА ВНИМАНИЕ!
Скачать презентацию Клонирование и экспрессия гистоноподобного HU белка из Mycoplasma
5baeae28103ec69c8488181b3f58fd1a.ppt